轮状病毒是导致小儿秋季腹泻的主要病原体。婴幼儿感染轮状病毒后,除了支持性治疗,目前尚无针对轮状病毒的特定抗病毒药物。盐酸二甲双胍是临床广泛使用的2型糖尿病药物,近年来先后发现它对心血管疾病、肿瘤、脱发等多种疾病具有治疗效果,研究表明二甲双胍在抗病毒方面也有一定效果,被誉为“神药”。在本课题中,我们的研究表明:盐酸二甲双胍具有抗轮状病毒作用。为了详细研究其抗病毒效果,我们分别在细胞、类器官和动物实验三个水平上构建了轮状病毒感染模型,用以检验盐酸二甲双胍对轮状病毒的杀伤效果。实验方法:1)MA104细胞用于扩增轮状病毒。用胰蛋白酶预处理的轮状病毒株SA11来感染生长状态良好的MA104细胞,待多数细胞发生病变后,收集至离心管中,于-80℃和37℃反复冻融细胞,离心,并收集上清液。然后重复该步骤,扩增7-8次后,收集病毒。检测病毒滴度并用倒置光学显微镜及透射电子显微镜观察轮状病毒形态。2)细胞实验。将盐酸二甲双胍稀释至0、0.1、1.0、10 m M,以CCK-8试剂盒检测盐酸二甲双胍与Caco2细胞的细胞毒性后,选择合适的盐酸二甲双胍浓度进行后续药物抗病毒效果实验。3)类器官培养。将C57BL/6小鼠解剖并分离出小肠隐窝,在体外于含有类器官生长所需生长因子的培养基中培养出类器官,隔天更换新的培养基,约7～8天传代。将类器官扩增至一定数量后备用。检测盐酸二甲双胍对类器官的毒性后进行后续的药物抗病毒效果实验。4)细胞与类器官感染模型:在培养的细胞与类器官中,加入适量滴度的病毒,然后以不同浓度盐酸二甲双胍（0、0.1、0.5、1.0 m M）在细胞及类器官中进行药物抗病毒效果表征。以q PCR检测轮状病毒SA11基因表达,Westerrn blot检测轮状病毒蛋白表达。免疫荧光观察病毒的荧光强弱。与此同时,以0、10、100、1000 IU/m L的干扰素IFNα-2a与各浓度盐酸二甲双胍联合作用于轮状病毒感染的Caco2细胞,检测联合用药的抗病毒效果。5)动物实验模型:实验动物分为三组,分别为注射病毒组、病毒注射后加药组、空白对照组。对6～9天的乳鼠腹腔注射轮状病毒,注射完成后每天观察小鼠的生存状态及腹泻情况,48 h后以90 mg/kg/d的用药量腹腔注射盐酸二甲双胍,注射完成后48 h后处死小鼠,取出小鼠小肠,分别检测轮状病毒在小肠内基因表达,制备石蜡切片,分别进行HE染色和免疫组化分析,观察病毒感染情况并分析盐酸二甲双胍杀伤轮状病毒效果。研究结果1)轮状病毒SA11感染MA104细胞后,细胞发生明显病变,扩增的轮状病毒TCID50效价为10^-5.875/0.1 m L,稀释100倍后用于细胞实验。轮状病毒感染Caco2细胞后,细胞发生明显病变。2)初步细胞毒性结果显示,盐酸二甲双胍浓度在0～1.0 m M范围内对Caco2细胞无毒性,10 m M盐酸二甲双胍具有明显的细胞毒性。浓度在0～1.0 m M范围,72 h内Caco2细胞存活率在80%以上。3)提取的小肠类器官经体外培养,逐渐出芽,7天后形成花瓣状三维小肠类器官,大小约200μm。在1.0 m M的盐酸二甲双胍浓度下,类器官的存活率低于80%,但是与其它浓度相比没有统计学差异。相比于细胞实验,类器官表现出较高的药物敏感性。4)细胞与类器官感染模型检测结果。盐酸二甲双胍的抗病毒检测结果显示,在Caco2细胞和类器官中,0.5和1.0 m M的盐酸二甲双胍均能显著抑制轮状病毒基因表达和蛋白质合成,这两种浓度下,在细胞中轮状病毒表达量分别是未加药组的0.532±0.094、0.464±0.061倍,而在类器官中则为未加药组的0.418±0.113、0.317±0.017倍。其中,0.5 m M的盐酸二甲双胍被认为安全有效的最适浓度。盐酸二甲双胍和干扰素联合用药结果表明二者没有协同或拮抗作用,可以分别单独用作抗轮状病毒药物。5)动物实验检测结果。腹腔注射病毒后,乳鼠小肠表达轮状病毒,未注射病毒的空白对照组未检测到轮状病毒基因表达。相比于注射药物组小鼠,单纯注射病毒组小鼠小肠肠上皮细胞空泡变性,绒毛脱落,病毒含量明显高于其它组。腹腔注射盐酸二甲双胍后,乳鼠小肠内轮状病毒的基因表达量仅为单纯注射病毒组的0.457±0.131倍。盐酸二甲双胍在体内表现出抗病毒作用。6)类器官模型是药物评价的有效模型。目前,开展药物评价常用细胞和动物模型,本研究证实了类器官比细胞具有更高的药物敏感性,类器官模型和动物模型的实验结果对比表明,盐酸二甲双胍具有相近的治疗效果。类器官有望替代部分动物实验,成为优于细胞水平的体外评价药物模型。