【摘 要】
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目的研究显示肝癌细胞与肿瘤微环境（tumor microenvironment TME）中的巨噬细胞之间可能通过外泌体的通讯来促进肿瘤的进展与转移。精准地阻断外泌体的通讯不仅会降低肝癌转移的风险,还可以避免对正常组织及细胞的不良影响。但是目前还没有通过阻断肝癌细胞与TME中巨噬细胞的外泌体通讯进而抑制肿瘤转移的方法。本研究的目的是验证外泌体通讯在肝癌转移中的作用、制备一种载药超声微泡阻断外泌体通讯
【基金项目】
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国家自然科学基金,81860308,超声触发载GW4869微泡干预肿瘤外泌体以防控肝癌射频消融后复发的效果与机理研究；
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目的研究显示肝癌细胞与肿瘤微环境（tumor microenvironment TME）中的巨噬细胞之间可能通过外泌体的通讯来促进肿瘤的进展与转移。精准地阻断外泌体的通讯不仅会降低肝癌转移的风险,还可以避免对正常组织及细胞的不良影响。但是目前还没有通过阻断肝癌细胞与TME中巨噬细胞的外泌体通讯进而抑制肿瘤转移的方法。本研究的目的是验证外泌体通讯在肝癌转移中的作用、制备一种载药超声微泡阻断外泌体通讯以防控肝癌转移。方法（1）巨噬细胞极化指标检测:模拟肝癌的肿瘤微环境,在0.4μm聚碳酸酯膜共培养小室中分别用正常肝细胞（7702）、肝癌细胞（Huh7）与巨噬细胞（RAW264.7）共培养后,显微镜下观察巨噬细胞形态的变化、q RT-PCR检测巨噬细胞CD206和Arg-1的m RNA表达、ELISA检测细胞上清IL-10和TGF-β的蛋白表达水平的值进行对比;（2）外泌体提取、鉴定及示踪:采用超速离心法进行肝癌细胞及巨噬细胞外泌体提取,TEM对外泌体的形态及大小检测,蛋白质印迹检测细胞与外泌体的CD63、TSG101两种标记物的表达;使用PKH67染色外泌体后与巨噬细胞共孵育,FV1000共聚焦显微镜观察外泌体是否被巨噬细胞内化;（3）载药超声微泡制备、表征及性能测试:以聚乳酸-聚乙醇酸（PLGA）为外壳,全氟烷气体为微泡充填剂,采用双乳化法（W/O/W）制备载GW4869的PLGA微泡;用扫描电镜对载GW4869的PLGA微泡进行表征,测定载GW4869微泡的形态、大小;用酶标仪及透析袋检测载GW4869微泡的载药率及释药率,用CCK8检测载GW4869微泡的细胞毒性;（4）载药超声微泡效能验证:用划痕愈合试验以及Transwell小室分别测定不同方式处理后的Huh7细胞得迁移和侵袭能力变化。结果（1）肝癌细胞和巨噬细胞共培养后导致巨噬细胞M2样改变:RAW264.7单独培养呈椭圆形,形态规整;Huh7与RAW264.7共培养后,镜下RAW264.7细胞形态不规则,主要呈多边形;收集共培养的RAW264.7,提取RNA逆转录后行q RT-PCR显示Huh7组巨噬细胞的M2型标记物CD206以及Arg-1的m RNA的表达明显高于7702组（P＜0.01）;获得细胞上清进行ELISA检测,Huh7组巨噬细胞的M2型标记物IL-10、TGF-β的蛋白表达水平显著高于对照组（P＜0.01）;（2）肝癌细胞通过外泌体导致巨噬细胞M2样改变:透射电镜显示超速离心法提取的外泌体切面图呈圆盘状,直径约50-100nm;TSG101、CD63是外泌体的典型生物标志物,蛋白质印迹实验证实了外泌体提取物中这些蛋白的存在,发现外泌体的上述生物标志物均呈阳性;用绿色荧光标记染料PKH67标记了的Huh7细胞外泌体与RAW264.7进行共孵育后显示,外泌体进入到巨噬细胞胞浆当中;Huh7外泌体（Huh7-Ex）共孵育后的巨噬细胞的M2型标记物CD206以及Arg-1的m RNA的表达明显高于正常肝细胞7702外泌体组（NC）（P＜0.01）,行ELISA检测显示Huh7-Ex组巨噬细胞的M2型标记物IL-10、TGF-β的蛋白表达水平显著高于NC组（P＜0.01）;（3）TAM来源的外泌体促进肝癌细胞的迁移与侵袭:与TAM外泌体共孵育后的肝癌细胞迁移及侵袭能力相比较显著强于对照组（P＜0.01）;（4）载GW4869微泡制备及性能测试:使用双乳化法制备的载GW4869的PLGA微泡呈圆球状,以去离子水将微泡制为乳白色混悬液体,微泡在显微镜下观察,显示大小欠均匀、分散程度好,扫描电镜观察载GW4869微泡直径约2-5μm,表面光滑,质地细腻,有小孔;酶标仪检测其实际载药率为（0.24±0.0083）%,包封率为（82.76±2.8）%;CCK8试验显示使用浓度为1000μg/m L的载GW4869的PLGA微泡与细胞共培养后,细胞存活率仍然大于80%;（5）载药微泡抑制肝癌细胞的迁移与侵袭:在模拟肝癌细胞与巨噬细胞的TME中加入超声击碎后的载GW4869微泡后,肝癌细胞的迁移及侵袭能力较对照组显著下降（P＜0.01）。结论肝癌细胞能够通过外泌体的通讯使巨噬细胞呈M2极化改变为TAM,TAM反过来又能促进肝癌细胞的恶性表型,使肝癌细胞的迁移及侵袭能力明显增高;制备的载GW4869微泡细胞毒性很低,微泡载药率及释药率可以满足实验要求;超声触发后的载GW4869微泡能够通过阻断癌细胞与微环境细胞间的外泌体通讯来降低肝癌细胞的迁移及侵袭能力。这可能会抑制癌症的进展,减少转移的发生,将为肝癌的诊疗一体化及精准定位治疗提供一种新的思维和策略。
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