背景目前,胃癌的发病率呈持续上升趋势,根据最新的流行病学统计,胃癌成为世界第五位常见的癌症,在我国是导致癌症患者死亡的第三大肿瘤相关原因。外科根治手术联合放化疗为主的综合治疗手段提高了胃癌患者的生存率,但由于胃癌的高度异质性,且容易发生耐药,总体预后仍然较差。浸润和转移是导致胃癌患者死亡的主要因素,探讨胃癌浸润、转移机制,有助于寻找胃癌治疗有效的靶向药物,改善患者的预后。羧基末端张力蛋白样分子（Tensin4,TNS4）是一种增强细胞运动的癌基因,在细胞多种生物学过程中发挥着重要的作用,包括增殖、分化、粘附、迁徙、浸润等。文献报道,Tensin4在多种恶性肿瘤,包括结直肠癌,胃癌,胰腺癌,乳腺癌,胸腺瘤,肺癌组织中表达水平增高,可以促进肿瘤侵袭和转移。Tensin4的作用机制非常复杂,多条通路和多种细胞因子参与Tensin4的表达调控过程,包括EGF,TGF-β,ERK,Snail,Kras,Stat3,β-catenin,ILK等。关于Tensin4调控胃癌细胞侵袭和转移的具体机制尚不清楚,因此有必要探讨在胃癌浸润和转移过程中,Tensin4与相关信号通路的作用机制,有助于寻找新的分子靶点,用于胃癌患者的预后风险预测和指导临床治疗。研究表明,Tensin4在肿瘤组织的上皮间质转化（EMT）过程中发挥重要作用。这些研究主要包括,Tensin4通过调节转录因子Snail的稳定性促进结直肠癌EMT进程;Tensin4通过激活TGF-β信号通路诱导肺癌和大肠癌的进展;Tensin4通过Ras/MAPK途径促进肝癌细胞增殖和迁移;Tensin4通过EGF介导STAT3促进肺癌细胞迁移和侵袭;在大肠癌的研究中显示,上调的Tensin4与细胞核中的β-catenin互相作用,可将β-catenin从E-cadherin分离出来,破坏粘附连接,导致E-cadherin发生降解,从而促进大肠癌EMT过程。PI3K/AKT信号通路在肿瘤细胞的增殖、浸润、迁徙过程中发挥重要的作用,该通路的激活是肿瘤细胞发生EMT过程的关键特征。GSK-3β、Snail是该通路下游的重要因子。在细胞因子EGF等的作用下,AKT第473位丝氨酸（Ser473）发生磷酸化生成p-AKT,在上游信号因子p-AKT的作用下,GSK-3β第9位丝氨酸发生磷酸化生成p-GSK-3β,可诱导Snail核转录增多。Snail可通过抑制E-cadherin的表达促进肿瘤细胞EMT的过程。AKT/GSK-3β/Snail信号通路是调节肿瘤细胞EMT进程的重要通路,该通路与细胞周期调控、细胞迁移和侵袭等运动过程密切相关,靶向抑制该通路中的任何一个步骤能抑制肿瘤细胞的浸润和转移。在胃癌细胞中,Tensin4与核转录因子Snail以及上游因子AKT、GSK-3β的作用机制尚未见报道。本实验旨在探讨Tensin4与AKT/GSK-3β/Snail信号通路在胃癌浸润和转移中的相关作用机制。目的1.检测Tensin4、p-AKT蛋白在胃癌组织以及胃癌细胞系中的表达,探讨二者表达的相关性以及与胃癌临床病理特点和预后的关系。2.检测敲减和上调Tensin4的表达以及阻断AKT通路后,胃癌细胞中AKT、磷酸化的 AKT（p-AKT）、GSK-3β、磷酸化的 GSK-3β（p-GSK-3β）、Snail 以及 EMT相关因子E-cadherin、Vimentin的表达水平变化。探讨Tensin4在靶向调控Snail的稳定性过程中,与AKT/GSK-3β信号通路的相关调控机制。3.在胃癌组织标本中进一步检测GSK-3β、p-GSK-3β、Snail的表达,分析Tensin4与三者表达的相关性和预后的关系,对细胞实验的结果进行验证,并建立裸鼠胃癌移植瘤模型,检测敲减和过表达Tensin4后,小鼠皮下成瘤能力和细胞增殖能力以及Snail的表达变化,探讨Tensin4与Snail的相关调控机制。方法1.采用免疫组化的方法,对80例胃癌组织和配对癌旁组织中Tensin4、p-AKT的表达进行检测,分析Tensin4与胃癌临床病理参数的关系以及Tensin4与p-AKT在胃癌组织中表达的相关性。分析Tensin4和p-AKT与胃癌患者术后五年生存率的关系,制作生存曲线和森林图,进行预后因素分析。2.应用RT-PCR法对10例胃癌组织和癌旁组织中Tensin4mRNA的表达进行检测,检测Tensin4mRNA在三株胃癌细胞系和正常胃粘膜细胞系中的表达,对各组细胞系中Tensin4mRNA的表达水平进行比较,找出表达水平最高和最低的细胞系。3.采用Western-blotting法检测敲减和过表达Tensin4以及阻断AKT信号通路后,胃癌细胞中位于AKT通路下游的EMT相关分子AKT、p-AKT、GSK-3β、p-GSK-3β、Snail、E-cadherin、Vimentin的表达。应用荧光原位杂交法检测Snail在细胞核内的表达水平变化。4.采用CCK8法、Transwell体外侵袭实验对敲减和过表达Tensin4以及阻断AKT通路后的胃癌细胞的增殖、运动侵袭能力进行检测,观察有无变化。5.应用免疫组化进一步检测胃癌组织和配对胃粘膜组织中GSK-3β、p-GSK-3β、Snail的表达,分析Tensin4与三者表达的相关性。按照Tensin4、GSK-3β、p-GSK-3β、Snail的表达将胃癌分为EMT表型和非EMT表型,对两种表型的预后进行生存分析,探讨Tensin4与GSK-3β、Snail的相关作用机制。6.建立胃癌小鼠移植瘤动物模型,检测敲减和过表达Tensin4后,胃癌细胞Snail、Ki67的变化,分析Tensin4对小鼠皮下成瘤能力和肿瘤细胞增殖能力以及Snail的变化,探讨Tensin4与Snail的作用机制。结果1.在胃癌组织和细胞系中,Tensin4的表达显著升高于正常胃粘膜组织和细胞。临床病理特征中与Tensin4表达密切相关的因素包括肿瘤浸润深度、有无淋巴结转移和TNM分期（P＜0.05）。Tensin4和p-AKT的表达呈显著正相关,二者均为胃癌预后的独立危险因素（P＜0.05）。胃癌细胞系SGC-7901中Tensin4mRNA高表达,胃癌细胞系MKN28细胞低表达Tensin4 mRNA。2.敲减Tensin4的表达后,胃癌细胞EMT进程受到抑制,胃癌细胞增殖,浸润和转移能力明显减弱。上调Tensin4的表达后,诱导胃癌细胞EMT进程,胃癌细胞增殖,浸润和转移能力增强。3.沉默Tensin4表达后,AKT、GSK-3β磷酸化过程受到抑制,Snail转核减少,胃癌细胞增殖、浸润和转移能力下降;上调Tensin4的表达后,诱导AKT、GSK-3β磷酸化,促进Snail转核,胃癌细胞增殖、浸润和转移能力增强。阻断AKT通路,可抑制Tensin4诱导的AKT、GSK-3β磷酸化过程,部分逆转Tensin4诱导的Snail转核增多,降低胃癌细胞增殖能力、浸润和转移能力。4.胃癌组织中p-GSK-3β、Snail表达明显高于癌旁组织,GSK-3β的表达低于癌旁组织。非EMT表型的预后好于EMT表型。在胃癌小鼠移植瘤模型,敲减和过表达Tensin4后,胃癌细胞中Snail、Ki67的变化趋势与Tensin4一致。结论1.Tensin4与胃癌的进展和预后明显相关,Tensin4与p-AKT的表达呈显著正相关,提示Tensin4与AKT通路的激活有关,二者均可作为胃癌患者预后的独立危险因素。2.Tensin4可促进GSK-3β磷酸化,Snail转核增多,上调胃癌细胞的EMT过程,增强胃癌细胞增殖,运动侵袭能力,提示Tensin4通过AKT/GSK-3β信号通路靶向调控Snail稳定性促进胃癌侵袭和转移。3.动物实验证实Tensin4能够靶向调控Snail的表达,增强小鼠皮下成瘤能力和细胞增殖能力。