【摘 要】
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野生莴苣（Lactuca serriola）是栽培莴苣（Lactuca sativa）的祖先,在莴苣的遗传改良中起着重要的作用,然而野生莴苣的散种（seed shattering）性状阻碍其种质资源的利用。莴苣在进化过程中由散种的野生莴苣进化为不散种的栽培莴苣,本研究想要通过正向遗传学的手段克隆控制莴苣散种的基因,为野生莴苣资源的利用提供理论依据。实验室前期利用Wo111×PI491245 F2散
【基金项目】
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校自主基金(莴苣散种基因的遗传克隆及其作用机理分析)； 国家自然科学基金（生菜紫色调控新基因（RLL5-7）的遗传克隆及生菜叶色的遗传网络解析）；
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野生莴苣（Lactuca serriola）是栽培莴苣（Lactuca sativa）的祖先,在莴苣的遗传改良中起着重要的作用,然而野生莴苣的散种（seed shattering）性状阻碍其种质资源的利用。莴苣在进化过程中由散种的野生莴苣进化为不散种的栽培莴苣,本研究想要通过正向遗传学的手段克隆控制莴苣散种的基因,为野生莴苣资源的利用提供理论依据。实验室前期利用Wo111×PI491245 F2散种分离群体中3,962株材料将散种候选基因定位到莴苣参考基因组6号染色体9.28～17.00 Mb,约7.72 Mb的较大区间内,猜想该群体可能存在交换抑制。为获得更小定位区间,接着又随机构建了3个F2分离群体,利用3个群体中共1,044株材料最终将散种性状的候选基因定位到6号染色体10.75～16.04 Mb,约5.29 Mb,该定位区间仍然较大。通过最新组装的栽培莴苣参考基因组和最新组装的该区段内野生莴苣基因组进行线性比对,发现定位区段内栽培莴苣的基因组发生倒置,倒置的位置是6号染色体11.22～15.76 Mb,栽培莴苣基因组在6号染色体14.77 Mb处丢失297 kb序列。分析倒置断点边界处序列,发现倒置断点并未在基因上,且断点附近也无基因。手工注释野生基因组中297 kb序列,该段主要是重复序列,不存在编码基因的序列。从定位区间163个基因中预测了7个候选基因,分别是LG6533864、LG6581063、LG6577075、LG6580918、LG6580935、LG6577149、LG6592781。构建预测基因对应的CRISPR/Cas9载体进行遗传转化实验,LG6533864获得编辑材料,但T0代杂合编辑和T1代纯合编辑的植株表型未改变,仍表现为散种,此基因被排除。LG6577149获得T0代杂合编辑植株,表型为散种,收种后已种植等待观察T1代表型。其它基因暂未获得编辑材料。实验室前期预测了2个基因,分别编码乙烯相关的转录因子（LG6581050）和多聚半乳糖醛酸酶（LG6580947）。LG6580947的CRISPR/Cas9载体获得T1代纯合编辑植株,但植株表型仍为散种。LG6581050的CRISPR/Cas9载体获得T1代纯合编辑植株,植株表型未改变;互补载体获得阳性材料,其T0和T1代植株表型未改变。这2个基因也被排除。在定位莴苣散种性状过程中发现Wo111和CGN10978 F2分离群体中茎表皮还存在红色和绿色的分离,但实验室前期克隆的5个调控莴苣叶片颜色的基因不能解释莴苣茎颜色的分离,推测存在新位点调控茎表皮花青素的生物合成。通过BSR-seq分析,利用1,790株材料将候选基因定位到1号染色体47.23～47.66 Mb,约0.43Mb。定位区间有15个基因,预测编码光敏色素PHYB的基因（LG1135654）可能控制莴苣茎表皮花青素的合成。比较该基因在两个亲本中的序列,该基因第3个exon存在一个SNP突变导致翻译提前终止。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对候选基因进行功能验证。以茎红材料为受体进行遗传转化实验,获得10株T0代杂合编辑的材料,表型为茎红,等待收种观察T1代表型。
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