马杜霉素免疫学快速检测方法的研究

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马杜霉素(Maduramicin,MD)又名马杜米星,是在1983年由Liu和Labeda在微生物Actinomadura yumaensis的发酵产物中分离得到的聚醚类离子载体抗生素的一种。马杜霉素对动物的球虫病具有用药量小、见效快和不易产生耐药性等优点,被广泛添加在畜禽饲料中。然而,这会造成马杜霉素在动物机体内残留、蓄积,食用这些动物组织可引起血管舒张,特别是诱发心脏冠状动脉扩张,引起患有冠状动脉疾病的人群的冠状动脉扩张,使病情恶化,很大程度上危害着人类的健康。随着科学技术的日益发展,新的、更高效的检测技术也在不断的被开发应用。目前已有微生物学检测方法、紫外分光光度计法、薄层色谱法、高效液相色谱法、液-质联用技术以及免疫学检测方法等。建立一种准确、快速、有效的检测食品中马杜霉素残留的分析方法,对于食品安全具有很大的实际意义。本研究在分析、制备马杜霉素人工抗原的基础上,运用单克隆抗体技术制备出马杜霉素单克隆抗体,组装马杜霉素ELISA试剂盒,并对其试剂盒的性能进行了评价,为马杜霉素的快速检测试剂盒的应用及推广打下了基础。现主要研究结果如下:1.马杜霉素人工抗原的制备与鉴定用混合酸酐法将马杜霉素与牛血清蛋白(BSA)、鸡卵清蛋白(OVA)偶联,合成人工免疫原MD-BSA和包被抗原MD-OVA,通过紫外分光光度计法(UV)、凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫小鼠获得的多抗血清的ELISA鉴定,表明MD-BSA偶联成功,获得效价和敏感良好的的多克隆抗体。2.马杜霉素单克隆抗体的制备及免疫学特性的鉴定用ELISA方法选择细胞融合用鼠,运用杂交瘤技术将免疫小鼠脾细胞与NS0瘤细胞进行细胞融合,经检测、筛选、克隆化后,获得1D11、2F9、3A5、4H5、4D9五株特异、灵敏的杂交瘤细胞株,用4H5杂交瘤细胞株注射小鼠诱生腹水制备MD McAb,制备出的腹水经鉴定亲和力较良好,对马杜霉素的IC50为1.455μg/L;与莫能菌素的交叉反应率为6.19%,且与鉴定的其他同类药物无交叉反应。通过试验获得了高价、灵敏和特异的马杜霉素单克隆抗体,可用于动物源食品中马杜霉素的残留的ELISA检测试验。3.马杜霉素残留免疫学快速检测方法的建立应用酶联免疫吸附试验系统的原理,用马杜霉素单克隆抗体研制出马杜霉素残留快速检测的ELISA试剂盒(MD-Kit)。制备出的MD-Kit标准曲线呈S型,线性关系良好,符合四参数Logistic曲线拟合,且效果良好;最低检测限为0.186μg/L;半数抑制IC50为0.175μg/L,变异系数小于<15%;对鸡肝与鸡肉分别添加5、10、100、200ng/ml MD标准品,平均回收率分别为71.225%和74.550%;MD-Kit性能稳定,在4℃避光保存3个月。
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