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鸡血藤为豆科(Leguminosae)密花豆(Spatholobus suberectus Dunn)的干燥藤茎,主产于我国广西、云南等地,具有补血活血,调经止痛,舒筋活络的功效。2015版《中国药典》中收录的“血藤”类中药材有“大血藤”、“鸡血藤”及“滇鸡血藤”三种,其中以鸡血藤的基原物种最多,多达26种,分属于6科12属。鸡血藤在中国沿用千年,但其基原复杂,亲缘关系不清晰,混伪品繁多,导致用药情况混乱,严重影响临床用药的安全有效。目前市场上商品鸡血藤药材主要来源于野生资源,由于多年的采收蕴藏量已很低。据本草记载,豆科崖豆藤属的多数物种可以作为“鸡血藤”的基原植物。因此,明晰药典收载的药材鸡血藤及其混伪品的基原关系为今后中药材市场鸡血藤药材使用的准确性和临床用药的安全性提供有利的科学依据,并为扩大寻找鸡血藤替代资源奠定科学的基础。目 的鸡血藤基原复杂,亲缘关系不清晰,混伪品繁多,导致用药情况混乱,严重影响临床用药的安全有效。本研究通过本草考证和CVH馆藏标本整理摸清崖豆藤属药用资源的蕴藏量、分布情况等;通过野外实地调查采集鸡血藤及其混伪品的实验样品;结合DNA条形码采用PCR扩增技术实现鸡血藤及其混伪品的准确鉴定;比较鸡血藤和丰城鸡血藤抗血虚的药效作用,为后续鸡血藤和丰城鸡血藤的研究提供一定的实验基础。方法1.本研究通过查阅国内外参考文献和本草著作摸清崖豆藤属药用资源、品种、药用部位、功效及蕴藏量、民族用药等情况,通过中国数字植物标本馆(Chinese Virtual Herbarium,CVH)(http://www.cvh.ac.cn/)馆藏标本对崖豆藤属药用植物的空间分布进行归纳,以期为崖豆藤属药用资源的充分开发利用提供参考并为后续研究提供实验基础。2.本研究通过参与全国第四次中药资源普查江西试点的普查工作,赴龙南、永丰及丰城等地采集崖豆藤属药用植物样本。采集过程中记录样品的采集日期、采集地点、经纬度及海拔等信息,并结合《中国植物志》检索表准确鉴定。采集的样品选取新鲜的植物嫩叶及时置于硅胶中干燥保存。3.采集72份鸡血藤及其混伪品的样本,分别提取样品DNA,以ITS2、matK、psbA-trnH、ITS和rbcL为引物扩增序列并测序;计算各序列扩增成功率和测序成功率,利用MEGA7.0分析比对序列特征;基于Kimura-2-Parameter(K2P)双参数模型计算种内种间的遗传距离评估Barcoding gap;利用Phylosuite软件构建ITS2、matK和psbA-trnH和多基因(I-M-P)联合系统发育树。4.本研究从建立复合型小鼠血虚模型,通过ELISA法检测血清中EPO的表达,测定G6PDH含量,HE染色法观察骨髓造血组织面积比和脾脏组织的变化来比较鸡血藤和丰城鸡血藤抗血虚的药效作用。结果1.从CVH馆藏标本中整理出26种崖豆藤属药用植物7222号标本,发现香花崖豆藤、网络崖豆藤及厚果崖豆藤在我国蕴藏量丰富,广西、广东、湖南、贵州、云南及江西六省资源丰富;野外采集香花崖豆藤、网络崖豆藤、丰城崖豆藤和厚果崖豆藤等共88份。2.对ITS2、matK、psbA-trnH、ITS和rbcL 5组DNA条形码序列进行评估,其中ITS2的扩增成功率和测序成功率最高,均为100%,matK和psbA-trnH的测序成功率亦有94.4%、91.7%,而rbcL和ITS仅为72.2%和61.1%。共获得72条ITS2序列、68条matK序列和66条psbA-trnH序列,通过MEGA7.0软件分析比对获得鸡血藤及其混伪品各样品ITS2、matK和psbA-trnH DNA条形码序列的变异位点信息。ITS2较其他条形码序列具有明显的Barcoding gap,且种内种间重叠少;系统发育树显示,ITS2、matK和psbA-trnH单基因序列可将鸡血藤及其混伪品明显聚为不同分支,I-M-P联合序列验证鸡血藤及其混伪品可明显聚为不同分支,而matK种间遗传距离较小,因此ITS2和psbA-trnH较matK更适于鸡血藤及其混伪品的鉴定,尤为ITS2的效果更佳,psbA-trnH次之。3.通过乙酰苯肼联合环磷酰胺建立小鼠复合性血虚模型,ELISA法检测血清中EPO表达和G6PDH的含量,给药组两者含量明显升高,模型组血清中的EPO、G6PDH的含量明显低于空白组(P<0.01),有统计学差异,说明模型建立成功。通过图像分析软件计算股骨骨髓HE染色切片的骨髓造血组织面积百分比,模型组的造血组织面积比明显低于空白组(P<0.01),鸡血藤高、中、低剂量和丰城鸡血藤高、中、低剂量(P<0.01),且与阳性组比较无显著性差异。HE染色法观察脾脏组织病理切片,给药组有明显恢复作用。结论鸡血藤为沿用千年的传统中药,但基原关系复杂,混伪品繁多,导致用药情况混乱,严重影响临床用药的安全有效。据本草记载,豆科崖豆藤属的多数物种可以作为“鸡血藤”的基原植物。本研究通过查阅国内外参考文献和本草著作初步摸清了崖豆藤属药用资源品种、药用部位、功效及蕴藏量、民族用药等情况。以DNA条形码分子鉴定技术成功鉴定出鸡血藤及其混伪品,并得出以ITS2为主、psbA-trnH序列为辅的鉴定方法作为鸡血藤及其混伪品进行快速、准确的鉴定手段,为鸡血藤临床用药的安全性和合理使用的准确性提供依据。并通过比较鸡血藤及丰城鸡血藤抗血虚药效作用,为后续研究两者药效作用机制奠定一定的实验基础。