一、研究背景登革热在世界范围内广泛流行,曾在多个国家发生多次大流行,每次发病均高达数百万之多,严重威胁全球100多个国家约25亿人口的健康,是全球面临的重大公共卫生问题。在东南亚及南美洲等高发病的国家和地区,登革热的流行大多经历了由输入性为主的疫情,经过多年流行,逐渐演变为多个型别并存,以至最终形成本地化地方性流行的过程,且流行地区和范围不断扩大。在中国,除云南省报告存在登革热自然疫源地外,其它地区尚未报告存在登革热自然疫源地。近年来,广东省每年均出现登革热病例,且福建、浙江也先后出现了本地感染的登革热暴发疫情,其它省份虽然未报告本地感染登革热病例,但报告发现输入性登革热病例的省份正在不断增多,仅2008年就有20个省、市、自治区报告有登革热输入性病例发生。广州市一直是广东省乃至全国登革热防控的重点地区,1978年至2010年先后出现了13个流行年份,20世纪80年代广州地区登革热处于较活跃的发病水平,进入90年代中后期流行强度基本处于较低水平,除1995年番禺沙湾镇发生暴发流行外,疫情相对平静,2001年后疫情又开始逐渐活跃,2002年、2006年和2010年发生较大规模的暴发流行。因此,广州一直将登革热作为重点防控和研究的传染病之一。登革热流行特征的变化,使广州是否存在登革热自然疫源地的问题备受关注。近年来疫情监测和病原生物学检测提示广州地区登革热似乎有演变为本地化的趋势：20世纪80至90年代,广州主要是输入性疫情引起本地传播流行,先后出现过DENV-1-4型病毒株的流行。但90年代以后本地流行多以DENV-1型病毒为主,而且分析发现2002与2003年之间、2006与2007年之间的病毒株具有较高的同源性；2006年发生登革热本地流行的毒株为DENV-1型,输入病例为DENV-3型,且大部分暴发点疫情未发现与输入病例间存在流行病学关联。同时,近年来对广州地区登革热病例的流行病学调查发现,有部分病例发病前并无外出史,当地亦未报告发现输入病例。此外,2007年在广州从化市邓村(为2006年登革热-暴发点)捕获的白纹伊蚊蚴虫中检出登革病毒核酸阳性,经基因测序确认为DENV-1型病毒。因此,有学者认为广州登革热己成为本地化的一种传染病。但是,广州登革热的流行究竟是潜伏于本地病毒株的循环还是外地病毒株传入的传播?广州地区是否出现由输入性疫情逐步向本地化疫情演变的态势?广州地区是否存在登革热自然疫源地?广州地区登革热流行和传播流行的规律等问题已成为广州地区登革热防控亟待解决的问题。二、研究目的探讨广州地区登革热传播流行演变的规律和模式,分析其分布范围和类型；回答广州地区登革热是输入性疾病还是本地化的自然疫源性疾病,明确广州地区是否存在登革热自然疫源地,为建立登革热疫情风险评估、预测预警机制,调整和制定登革热防控策略提供依据,进而提高疫情防控效率、节省社会资源、保护社会劳动力、增进人群健康。三、研究内容及方法(一)研究内容(1)分析广州地区1978-2010年登革热疫情数据,掌握不同时期登革热流行的特征、趋势及动态变化；(2)调查广州地区人群登革病毒抗体水平,研究人群隐性感染水平,评估健康人群的易感性；(3)对2001-2010年分离的登革病毒流行株进行基因测序,建立广州地区登革病毒分子生物学信息库,构建登革病毒基因进化树,确定流行株来源及变异；(4)调查广州地区登革病毒主要传播媒介白纹伊蚊的病毒携带情况；(5)对广州地区主要宿主动物进行登革病毒的感染状况进行调查。(二)研究方法(1)现场流行病学方法：对广州地区登革热疫情流行特征开展详细的现场调查和分析；在新旧登革热疫点以及全市设立的代表性蚊媒监测点,捕获足够数量的白纹伊蚊成虫或蚴虫以及主要宿主动物,开展登革病毒携带情况调查。(2)地理流行病学方法：对广州地区登革热病例的地理分布,毒株来源进行描述。(3)分子流行病学方法：采用C6/36细胞培养登革病毒,提取病毒RNA,采用RT-PCR扩增E基因并测序,采用DNAstar软件中的Seqman程序拼接组装完整的E基因序列,与GenBank中的病毒参考株进行比较,用ClustalXl.83进行多序列比对,应用MEGA4.0软件采用Kimura校正模型的邻接法构建系统发生树,分析各病毒株间的同源关系及可能来源。四、研究结果(一)广州地区1978～2010年不同时期登革热流行特征(1)广州登革热的发生经历了三个流行时期,出现13个流行年份,存在周期性间断增多的现象,3至5年出现一个发病高峰。(2)4个型别登革病毒在广州均先后出现过流行,除1991年出现DENV-1、DENV-4本地感染病毒株先后交替流行,2010年4个型别病毒株共同流行外,其余年份疫情均由单一型别病毒引起。(3)广州5至12月份均有登革热本地病例发生,存在明显的季节性发病高峰,7至10月份为高发月份。(4)老(中心)城区发病较高,城郊结合部发病次之,农村发病较低,1978至2010年累计病例数排在前三位的是番禺区,海珠区和越秀区。(5)广州登革热发病率低,发病率最高的年份是1995年,发病率达83/10万。病死率亦低,1978年至1991年广州因登革热而死亡的病例累计报告12例,此后一直无因登革热而死亡的病例报告。(6)年龄、性别分布：男女发病基本一致,发病年龄涉及全年龄组人群,但以20～40岁年龄组为主,职业以家务待业,工人和离退人员为主。(7)输入病例时常发生：2006-2010年,除1月份无输入性病例报告外,其余月份均有输入病例报告,输入来源于世界各流行区,其中以东南亚国家和地区为主。输入病例病原学监测结果显示4个型别登革病毒均有分离到,病例除有出境流行病学史外,且均在一个最长潜伏期内发病。(二)广州地区人群登革热血清学抗体水平调查分析(1)广州地区人群登革热抗体水平低。共采集疫区(点)人群904份血清标本,其中仅7份IgG抗体阳性,阳性率0.77%(7/904)；非疫区(点)人群1347份,IgG抗体阳性3份,阳性率0.22%(3/1347),疫点和非疫点人群抗体阳性率无统计学差异(P>0.05)。疫区(点)人群各年龄组抗体阳性率有统计学差异(P<0.05),非疫区(点)的人群各年龄组抗体阳性率无统计学差异(P>0.05)。(2)暴发点人群隐性感染率较低。2009年和2010年对4个暴发点人群的登革热隐性感染情况进行调查,发现各暴发点人群隐性感染率较低,在0.0%-2.0%之间。(三)广州地区登革热分子流行病学及溯源调查和分析2001-2010年间共分离获得登革病毒流行株130株,按年份、型别、输入株、本地株进行分类,开展基因测序,建立登革病毒生物信息库,并在几起典型的溯源调查案例中成功应用,探明广州地区登革病毒的来源及分子生物学特征,明确广州地区登革热流行的性质及传播流行规律：(1)2006年共分离培养DENV-1型病毒10株,其中2例输入病毒株分别来自印尼和多米尼加,均与广州本地流行株无关联,系统发生树分析表明2006年DENV-1代表分离株GZ06/1707与柬埔寨(1998年)、泰国(2001年)和缅甸(2001年)流行株接近。(2)对2009年广州DENV-1型病毒流行株E基因序列分析,发现4株DENV-1型病毒核苷酸序列同源性在90.5%-100%之间,同源性比较和系统发生树提示病毒株09/GZ/11562和09/Gz／11534与GZ061707(2006年)、FJ231/04(2004年)有较高同源性,甚至09/GZ/11562与GZ061707为相同的氨基酸序列。(3)对广州2009年新现7株DENV-3型病毒E基因序列分析发现,病毒株1081、1483、10806毒株核苷酸(氨基酸)同源性在99.9～100%(99.8～100%)之间,而病毒株10616、11144、11194、13105毒株核苷酸(氨基酸)序列同源性在99.7-100%(99.8～100%)之间。此外,该7株DENV-3型毒株与2株中国流行株98TW407(1998年)、80-2(1980年)比较,发现病毒株1081、1483、10806株与中国广西80-2株的核苷酸(氨基酸)序列相似度在99.5-99.6%(99.4-99.6%)之间,与GenBank中28株全球不同地区的DENV-3型E基因序列绘制系统系统发育树,表明1081、1483、10806株属于东南亚／南太平洋型,10616、11144、11194、13105株属于印度次大陆型。(4)对2010年广州景泰街一起DENV-4型登革热暴发进行调查和分析,分离到的5株DENV-4型登革病毒核苷酸同源性在99.9%-100%之间,其中CH/Guangzhou10660/2010病毒株与日本2002年分离的泰国输入株02-12-1HuNIID核苷酸同源性最高,达98.9%,其次为印度尼西亚2004年分离的SW36i株,核苷酸同源性为98.8%,而与广州1990年Guangzhou B5株的核苷酸同源性仅93.9%。E基因系统发育树也表明CH/Guangzhou10660/2010株与上述同源性较高的毒株关系最近,而与泰国1977年ThD4-0087/77株、1991年ThD4-0348/91株、2001年ThD4-0485/01株、广州1990年Guangzhou B5株亲缘关系较远,与泰国1997年ThD4-0017/97株和ThD4-0476/97株亲缘关系最远。(5)对2009年新现和2010年再现的13株DENV-3病毒进行同源性分析发现,2010年除10/GZ/10549毒株与其外5株有8.9%-9.3%核苷酸差异和3.3%-4.5%氨基酸序列的差异外,其外5株DENV-3型病毒核苷酸同源性在99.5%-100%之间,而推导氨基酸一致性在98.7%-100%间。2009年7株分属基因Ⅰ型和Ⅱ型,分别与菲律宾和日本分离株相近。2010年6株也分属基因Ⅰ型和Ⅲ型,分别与印度尼西亚和坦桑尼亚相近。(6)对2010年全年14株DENV-4病毒核苷酸序列的同源性在99.9%-100%之间,推测的氨基酸序列同源性100%,选取代表株GZ/2010/11580与广东佛山1978年DENV-4流行株(CN78-56)、广州1990年流行株(B5)、Indonesia2004年(SW38i),Indonesia2007年(0712aTw)流行株,以及森林株P7321120b,进行同源分析,发现广州2010年DENV-4毒株与印度尼西亚2004年SW38i毒株、2007年0712aTw毒株同源性较高,基因进化分析提示GZ/2010/11580离SW38i,0712aTw最近,属于同一分支。(7)对广州2001-2010年广州90株登革病毒分离株进行总体溯源分析表明：广州多数病毒株与东南亚国家或地区先前流行的分离株相近。如DENV-1:2002年分离株与印度尼西亚1998年分离株近似,2007年分离株与2004年马来西亚行株相近,2008年分离株与越南2003年分离株相近；2010年DENV-2分离株与2006年越南分离株相近似；2010年广州DENV-3分离株与2007年印度尼西亚分离株相近似；而2010年广州DENV-4分离株与2004年马来西亚分离株相近。(四)广州地区登革热传播媒介登革病毒携带调查研究对采自广州地区不同监测点和疫点的白纹伊蚊幼虫或成蚊标本采用RT-PCR方法进行病毒携带检测：2005年至2007年共采集检测白纹伊蚊幼虫493批次,除在2006年8月份检出1批阳性样本,2007年一采自旧疫点的蚊虫中检出2份病毒核酸阳性标本外,其余标本检测结果均为阴性,阳性标本经测序鉴定均为DENV-1型。而在2008年-2010年连续三年,在广州24个自然环境监测点(包括外环境和民居室内,以登革热新旧疫点为主)采集白纹伊蚊幼虫标本,共获得白纹伊蚊标本658批,登革病毒RT-PCR检测结果全部为阴性。(五)自然环境中主要宿主动物调查研究共采集检测动物血液或脑细胞标本1653份,其中狗血液标本266份,鼠血液标本916份、猪血液标本300份,猫血液标本121份,蝙蝠脑细胞标本50份,阳性对照均能扩增出相应的条带,但经重复验证后,最终确认全部采集的动物标本登革病毒RT-PCR检测结果均为阴性。五、研究结论通过对广州地区1978～2010年登革热疫情流行特征及趋势的分析,对登革热疫点地区和非疫点地区人群登革病毒抗体水平的血清学调查,自然环境中主要传播媒介白纹伊蚊登革病毒携带的调查,以及自然环境中主要宿主动物登革病毒感染状况的调查,特别是运用分子生物学检测和分析技术对历年来获取的病毒株进行的几起典型案例的同源性或溯源分析表明：当前广州地区登革热流行仍属“输入或因输入引起本地传播流行”特征,尚未“本地化”或演变为登革热自然疫源地。主要依据如下：(1)病例性别和年龄分布无明显差异,发病年龄以20-40岁青壮年为主,而非以婴幼儿等低年龄为主；(2)广州地区人群登革病毒抗体水平低,人群普遍易感,暴发点地区人群隐性感染率亦较低,呈现感染即发病的特征,这亦与一传染性疾病呈现本地化流行的人群抗体水平特征不符；(3)对各监测点传播媒介白纹伊蚊样品连续六年的监测和检测表明,除2006年和2007年有2批次标本PCR检测结果为阳性外,其余蚊媒标本登革病毒PCR检测结果均为阴性,未发现广州地区自然环境中白蚊伊蚊携登革病毒越冬或经卵传递的生物学证据；(4)自然环境中主要宿主动物登革病毒携带检测,未发现感染登革病毒的证据；(5)对广州地区近年来几起典型案例所分离获取的登革病毒E基因序列的分析显示广州地区登革病毒分离株同非洲、美洲,尤其是东南亚国家和地区的分离流行株高度同源,关联性较高。综上所述,广州地区登革热流行仍是输入疫情引发本地感染的流行态势,并未成为为本土化疫情,演变登革热自然疫源地。但广州存在有利于登革热流行的自然和社会因素条件：(1)地处亚热带,年平均气温高,降雨量大,气候条件适合登革热传播媒介白蚊伊蚊的生长,客观上利于登革热疫情的发生；(2)人口流动越来越频繁,疫情的国外输入及区域间传播风险和概率增加,疫情涉及的地区不断扩大,特别是城市型登革热疫情可以在蚊媒密度较低的情况下低强度流行,并在人口流动频繁的情况下迅速向外蔓延及传播；因此,不排除若干年后,登革病毒与其他宿主动物和媒介伊蚊进一步适应后,广州地区登革热将逐渐演变为地方性流行的传染病疾病,即形成自然疫源地的可能。