研究背景：在现代社会,随着人们生活节奏的加快以及各方面压力的不断增加,颈肩痛和腰腿痛的发生率越来越高。椎间盘退行性改变(intervertebral disc degeneration, IDD)是导致颈肩痛和腰腿痛发生的最主要原因,特别是随着我国社会老龄化进程的加快,椎间盘退行性改变所致的脊柱疾病越来越受到人们的关注。由于椎间盘解剖结构的特殊性,其一旦发生损伤和退变就很难完成自行修复,而且其退变过程往往是不可逆的。其实人的椎间盘组织在20岁就已开始了退变,这是多变的外部环境因素和生理老化共同作用的结果。进一步研究表明：髓核是维系椎间盘生理功能的重要单位,椎间盘的早期退变通常是源于髓核组织及其组分的改变。在椎间盘组织发生退行性变的过程中,髓核水分开始减少,组织中糖胺聚糖等细胞外基质含量呈现明显下降,椎间盘的多种物理化学性能也发生改变,进而引起机体椎间盘在结构和功能上的进一步变化,致使椎间盘的形态与功能无法得到正常维持。因此,我们以髓核为中心,研究能够修复再生退变髓核组织的有效方法,进而达到逆转与修复退变椎间盘的目的。组织工程作为一门不断发展与创新的新兴技术,相关研究正变得越来越热门,这一技术完全有可能作为修复组织缺损的理想方法,而目前组织工程技术在许多领域的应用已日趋成熟,这也为我们利用组织工程学方法重建具有生物学功能的椎间盘髓核组织提供了充分借鉴。在髓核组织工程领域中,对于支架材料的研究显得尤为重要,构建的组织工程髓核支架应尽量模拟髓核的生长环境,为种子细胞提供粘附增殖的空间,可促进细胞的增殖分化,最终形成新的髓核组织,达到髓核再生修复的目的。虽然目前已有大量天然生物材料、人工合成材料及其复合材料支架被用于髓核组织工程的研究当中,如藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖、Ⅱ型胶原和透明质酸等,但是在生物相容性、细胞黏附性、生物力学性能、模拟体内微环境等诸多方面还有待于进一步改善。目前,利用组织脱细胞技术制备天然细胞外基质支架作为组织工程支架材料的来源是一种新的趋势,因将细胞成分这一主要抗原物质脱除,从而往往具有良好的生物相容性,其细胞毒性及抗原性更低,且具有较为理想的三维立体多孔结构,尽量保持了组织内部形态结构的稳定,接近正常组织的生物学性能。目前,脱细胞技术在构建组织工程化角膜、气管、皮肤、心瓣膜、血管、软骨等诸多领域得到了广泛应用,对本研究具有重要的借鉴意义。有相关的实验研究探讨异种脱细胞椎间盘或髓核支架直接用于人体研究,但异基因种属间还有诸如免疫排斥、生物力学相似性等许多问题需要我们去考虑,而同种异体组织脱细胞支架在这些方面也许能更好地解决这些问题。现阶段我们以兔为动物实验对象,通过动物实验来验证同种异体脱细胞髓核支架应用的可行性,为将来的人体实验以及临床治疗方法的探索奠定理论和技术基础。目前应用于各种组织脱细胞的方法有多种,其机制基本都是通过一系列方法处理同种异体组织器官,使该组织器官的细胞成分完全去除,从而保留相应的细胞外基质。常用的脱细胞方法主要为去污剂处理法、酶处理法和物理处理法。我们参照国内外相关研究经验,通过大量的前期预实验研究,得出了一套较为完善的兔髓核脱细胞方案。对于我们的研究来说,选取适宜的种子细胞,对于支架性能的评价具有重要意义,兔骨髓间充质干细胞较易获取、培养,且来源稳定,具有多向分化潜能,在体内向髓核细胞分化的能力较强,因而是髓核组织工程理想的种子细胞。因而,我们将此实验总共分为两个部分：第一部分为兔骨髓间充质干细胞的分离、提取、培养及鉴定；第二部分为脱细胞髓核基质支架的制备和获取,对组织脱细胞程度及细胞外基质成分保留情况进行评估,并对该支架进行体外生物学相关性能初步检测。研究目的：应用去污剂及核酸酶法初步制备兔髓核脱细胞支架,利用组织病理学、分子生物学等多种方法评价其脱细胞效果及细胞外基质保留情况,并结合骨髓间充质干细胞,体外综合评价该支架的含水能力、生物力学、生物相容性、细胞黏附生长等多种相关性能,初步探讨和评估所制备的脱细胞基质支架是否有条件成为髓核组织工程研究理想的支架来源,为进一步的体内实验研究奠定基础;同时通过目前的动物实验研究,为同种异体脱细胞髓核的技术与理念能够在将来用于人体临床研究与应用提供理论和实验基础。研究方法：第一章兔骨髓间充质干细胞的分离、提取、培养及鉴定。在无菌条件下,采用全骨髓穿刺法从3周龄健康新西兰大白兔股骨和胫骨骨髓中抽取原代兔骨髓,通过密度梯度离心法分离获得兔原代骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMSCS),接种至100ml细胞培养瓶中进行体外培养,观察其细胞形态、贴壁率,通过免疫组化的方法检测细胞表面标记物CD44、CD90和CD45的表达情况,并进行干细胞成骨诱导证明。第二章脱细胞兔髓核支架的获取与相关性能的体外初步评估。我们将2.5-3kg新西兰大白兔(雌雄不限)作为髓核组织的供体,利用化学去污剂联合核酸酶法对取材的髓核组织进行脱细胞处理。通过HE染色、免疫组织化学以及细胞核DAPI荧光染色,并联合生物化学方法进行DNA含量和基质成分葡萄糖胺聚糖(GAG)的定量分析,从而鉴定细胞成分的脱除效率及细胞外主要基质成分的保留情况,并通过扫描电子显微镜来观察材料的组织结构和表面显微结构的变化。测试支架材料的含水能力从侧面了解其物理性能的变化,同时对材料的压缩弹性模量进行测试用来评估脱细胞处理之后的生物力学特性的变化。我们用接触和浸提液细胞毒性实验来检测支架材料的生物相容性,并将骨髓间充质干细胞接种在材料上观察细胞与材料的相互作用。综合以上方法,最终对该脱细胞髓核支架有一个初步的体外性能评估。研究结果：第一章兔骨髓间充质干细胞的分离、提取、培养及鉴定。兔骨髓间充质干细胞体外分离培养,其增殖迅速,短时间内可大量扩增,达到需要的种子细胞数量要求。一般于24h后可见大部分贴壁,细胞呈短梭形；第3-5d可见贴壁生长细胞数目明显增多,细胞界限不清,细胞形态呈多角形或梭形,呈集落样分布；第8-l0d后细胞基本长满瓶壁,排列规律呈旋涡状或鱼群状,可进行传代,传代后细胞仍然保持旺盛的分裂增殖能力,形态基本一致且状态良好。免疫组织化学检测显示分离培养的兔骨髓间充质干细胞表面标记物CD44、CD90表达呈阳性,CD45表达呈阴性,符合骨髓间充质干细胞的特征；干细胞成骨性诱导后逐渐形成小的钙盐结晶体,细胞碱性磷酸酶染色呈阳性,Von Kossa染色也显示细胞聚集处存在大量黑色钙盐沉积。第二章脱细胞兔髓核支架的获取与相关性能的体外初步评估。在经过TritonX-100与脱氧胆酸钠联合核酸酶的脱细胞处理后,HE染色、免疫组织化学、细胞核DAPI荧光染色及DNA定量检测提示支架材料中的细胞成分基本被去除,同时免疫组化及扫描电镜观察提示细胞外基质胶原纤维结构未见有明显破坏,基质主要成分如GAG的含量通过GMMB法检测提示较正常髓核组织虽有部分丢失,但未见有明显统计学差异；脱细胞处理后支架材料的压缩模量及含水能力均有轻微程度的下降,但亦无统计学差异；通过死活细胞荧光染色及CCK-8法检测显示材料及其浸提液对种子细胞没有毒性,而且支架材料支持骨髓间充质干细胞在其上黏附和增殖。研究结论：骨髓间充质干细胞来源稳定,取材容易,在一定外界条件下可定向分化且生长活跃,可以作为髓核组织工程种子细胞的良好来源；化学去污剂TritonX-100与脱氧胆酸钠联合核酸酶消化法可以有效脱除细胞结构成分,较好地保留细胞外胶原纤维基质结构,对基质内的GAG等成分含量存在一定的影响,但影响并不十分显著；虽然材料的力学强度及含水能力等也有轻微降低,但是对支架材料的整体性能影响同样不明显,并不影响该支架材料运用的可行性；同时,支架具有良好的生物相容性,并且能够较好地支持种子细胞的黏附与增殖。本实验所制备的脱细胞髓核基质支架细胞脱除干净,细胞外基质成分与结构保留情况较好,初步评估具备了良好的体外相关生物学性能,有可能成为髓核组织工程研究理想的支架来源,为进一步体内实验研究及同种异体脱细胞髓核的技术与理念能够在将来用于人体临床研究奠定良好的基础。