鉴别不同生物基因组的差异及其序列信息，有助于揭开物种间进化的规律，对于分子层面上的物种进化研究具有重要意义。对于近源物种，鉴定不同基因组之间差异序列，可以阐明与某些重要性状形成有关的基因，以及这些基因如何发挥作用。对于亲源关系较远的物种，差异序列可以作为构建进化树中的中间标记物种。如物种的全基因组测序完成后，可通过计算机进行数据库分析，直接找出物种间的差异。但对于基因组过于复杂的真核生物而言，目前难以对所有生物进行全基因组测序。 近年来，出现了很多分离和鉴定物种之间差异序列的方法。这些方法大都是建立在差减杂交的基础上，基本原理是去除二者之间的共有序列，使差异序列得到富集。差减是否彻底是差减杂交能否成功的瓶颈，因此如何判断差减是否完成成为差减杂交最值得关注的问题。但现有的差异分析方法中，尚无有效的措施监控杂交过程，容易造成高假阳性。代表性差示分析（representative difference analysis，RDA）将“动力富集”引入PCR为基础的差减杂交，但这种方法过于烦琐，操作不当容易产生高假阳性。同时由于差减后，差异片段与过量的driver DNA混杂在一起，使得PCR扩增差异片段时的模板DNA 的复杂度大大增加，大大降低了差异片段的扩增效率，导致覆盖率的降低，因此本方法通常用于两个差异极小的基因组或基因的差异表达。以抑制PCR为基础的抑制消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH），被认为是目前分析基因组差异最有效的方法，已成功用于简单基因组差异分析和差异表达研究。但因没有合适的杂交对照，很难用于复杂基因组之间的差异分析，尽管Clontech公司生产的SSH试剂盒可以监控杂交过程，但因对照系统并不能真实反映样品的杂交条件，如DNA样品的复杂度、浓度、质量。这些缺点使其很难判断杂交进程，容易造成假阳性。由于现有方法存在很大缺陷，对于差异多、基因组复杂的真核生物而言效果并不理想。本研究中，建立了一种分析复杂基因组之间差异序列的方法—杂交监控差异分析法（hybridization monitored differential analysis，HMDA）。在消减杂交的基础上引入了一种杂交监控体系，可以对整个杂交过程进行全过程监控。 本方法是一种建立在PCR基础上的固相消减杂交，主要内容包括：待比较的两个基因组分别称为tester 和driver，将driver 固定在直径为6mm正电荷尼龙膜上，与液相中连接有接头的tester 杂交。通过与固定在杂交膜上的driver 杂交，可去除tester DNA中的共有序列，差异序列逐渐被富集。每轮杂交结束后，更换新的固定有driver的杂交膜。当在tester中，PCR检测不到共有序列时，杂交结束，剩余的片段即为tester特异的片段。本研究中，经过条件优化，建立一种杂交监控体系，用于监控整个杂交过程。将18S rDNA作为共有序列的代表，根据其保守区域设计引物，通过PCR检测消减杂交后tester中18S rDNA，判断杂交进程，实现对杂交过程的监控。经过几轮杂交，如在tester 中检测不到18S rDNA，说明tester中的共有序列已全部去除，剩余的片段即为tester特异片段。用接头引物扩增差异片段，可直接克隆到T载体中，构建成差减文库。由于消减后，tester中剩余的DNA主要为差异片段，大大降低了差异序列扩增时模板的复杂度，提高了差异扩增效率，进而提高了差异覆盖率。 为证实此方法的有效性和可行性，本研究中，以完成全基因组测序的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）为实验材料，分离鉴定了S. Cerevisiae 的特异序列，并对杂交监控差异分析法（HMDA）的覆盖率、差异片段富集效率以及所得到的差异片段的比例进行了分析。 选择S. Cerevisiae 18S rDNA的一段保守序列作为杂交监控序列，与包括S. Pombe在内的其他生物进行相似性分析，结果显示，相似性均在70％以上。根据这段序列设计引物，退火梯度PCR结果表明，最佳退火温度为60℃，扩增产物为180bp；模板中的杂交缓冲液对Taq 酶有一定的抑制作用，以含不同浓度杂交液的tester DNA作模板，扩增18S rDNA，结果显示，终浓度为0.02－0.01×SSC的扩增体系不影响PCR扩增。因此，在25 μl扩增体系中，加入0.2 μl 含tester的杂交缓冲液（5×SSC），可直接进行杂交监控分析；此反应条件下，PCR最低可以检测100fg的基因组DNA；在包括真菌、植物、昆虫和人在内的其他生物中，用这对引物也能扩增到目的带，说明此片段及其引物可用于大多数真核生物的差异分析。 将tester DNA用Tsp509I酶切，酶切产物集中于200-800bp之间。超声波打断的driver DNA在尼龙膜上固定效率通常为60-70％。通过18S rDNA的PCR扩增，检测固定有driver DNA的尼龙膜的漂洗过程，结果显示，用5×SSC漂洗杂交膜两次，每次30min，2×SSC漂洗2次，每次30min后，漂洗液中检测不到18S rDNA，说明经上述漂洗后的膜，可用于后续的杂交反应。Driver和tester按800：1的比例进行杂交时，经过四次杂交，tester中检测不到18S rDNA，杂交完毕，各轮杂交后的PCR产物的电泳图谱有明显变化，逐渐出现明显的条带。 差减克隆的测序结果显示，插入的DNA片段平均为410bp，最大为1100bp，最小为86bp。用Blast相似性分析显示，60个测序的独立克隆中，57个（95％）与driver无相似性，3个（5％）是假阳性，与driver有不同程度的相似性。差异序列分布于酿酒酵母的13条染色体上。52个单拷贝片段中，49个（94％）为差异序列，而8个多拷贝序列均为差异片段（100％）。 从消减文库中随机挑选一差异片段，地高辛标记后作为探针，筛选S. Cerevisiae差减文库和未差减质粒文库，结果显示，经过四轮杂交，差异片段约富集了240倍，平均每轮富集4倍。 差异覆盖率即能找到全部差异序列的可能性。在S. Cerevisiae核酸数据库中，从16条染色体上随机挑选差异序列，根据序列设计引物，以tester最终杂交产物为模板，用这些引物扩增，根据能扩增出目标片段的引物的比例计算差异覆盖率。结果显示，HMDA所得到的差异覆盖率为79％。