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苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californica multiple nuclepolyhedrovirus,AcMNPV）ac16是α-杆状病毒Ⅰ组17个特有基因之一,其编码产物AC16是病毒结构蛋白,与出芽型病毒粒子（Budded virions,BV）和包涵体衍生型病毒粒子（Occlusion derived virions,ODV）的囊膜关联。此前研究表明AC16参与病毒囊膜蛋白的运输过程。本实验室早期通过酵母双杂交实验,从Sf9细胞的cDNA文库中筛选出可与其相互作用的Arp2/3复合物亚基P21,初步确定其相互作用位点位于AC16AA81-100区段。本实验为探究AC16与P21相互作用的关键位点,主要进行了以下研究:首先,通过基因操作分别构建敲除AA81-100、AA86-100和AA90-100编码序列的缺失突变体AC16Δ81-100、AC16Δ86-100和AC16Δ90-100以及8个保守位点的点突变体（将第91、92、93、94、95、96、98和99位氨基酸密码子分别突变为丙氨酸密码子 A）K91A、K92A、N93A、E94A、I95A、I96A、E98A 和 L99A。将用这些突变体构建的酵母双杂交诱饵质粒,分别与包含P21编码序列的cDNA克隆做杂交实验。实验结果显示:AC16×P21平板上长出大量单菌落,AC16Δ81-100×P21、AC16Δ86-100×P21、AC16Δ90-100×P21杂交平板上仅长出少量单菌落;在AC16单点突变体与P21的杂交实验中:与AC16×P21相比,AC16 K91A×P21平板上的菌落明显减少,其余实验组 K92A×P21、N93A×P21、E94A×P21、I95A×P21、I96A×P21、E98A×P21、L99A×P21平板上均长出较多单菌落。随后,利用双分子荧光互补实验对AC16及其突变体与P21的相互作用做进一步验证。利用Bac-to-Bac系统分别构建表达AC16或其突变体与黄色荧光蛋白YFP C155的融合蛋白和P21与YFPN173融合蛋白的重组病毒,用其分别转染Sf9细胞。实验结果显示:在表达AC16-YFP C155和YFP N173-P21 的报告病毒vAcac16-c155n173-p21转染的细胞中可观察到强黄色荧光;在表达AC16互作区段缺失突变体-YFP C155 和 YFP N173-P21 的报告病毒 vAcac16Δ81-100-c155n173-p21、vAcac16Δ86-100-c155n173-p21 和 vAcac16Δ90-100-c155n173-p21 转染细胞中只能观察到微弱黄色荧光;在 AC16 K91A 和 I95A 突变体报告病毒 vAcK91A-c155n173-p21 和 vAcI95A-c155n173-p21分别转染的细胞中也只呈现微弱黄色荧光,在AC16 K92A、N93A、E94A、I96A、E98A和L99A突变体报告病毒转染的细胞中,黄色荧光比较明显,但呈现黄色荧光的细胞数量比较少,而且细胞中荧光强度均弱于vAcac16-c155n173-p21转染细胞。这些表象表明AC16AA81-100、AA86-100、AA90-100区段的缺失将导致AC16与P21的相互作用接近消失,证实AA81-100区段为AC16与P21的相互作用区段;表明AC16第91位的赖氨酸和第95位的异亮氨酸对AC16与P21的相互作用至关重要。同时为了探究AC16与P21的相互作用对AC16及P21在Sf9细胞中定位的影响,我们通过Bac-to-Bac系统分别构建了表达AC16或其与P21互作区段缺失突变体与绿色荧光蛋白EGFP的融合蛋白和P21与RFP融合蛋白的重组病毒vAcegfp-ac16-p21-rfp和vAcegfp-ac16Δ81-100-p21-rfp,用其分别转染Sf9细胞,72hpt时利用激光共聚焦显微镜观察。结果显示:在表达AC16-EGFP和P21-RFP融合蛋白的报告病毒vAcegfp-ac16-p21-rfp转染的细胞中和表达AC16与P21互作区段缺失突变体-EGFP和P21-RFP融合蛋白的报告病毒vAcegfp-ac16Δ81-100-p21-rfp转染的Sf9细胞中,AC16与P21的定位均未发生变化,AC16蛋白均匀的分布于细胞核中,大部分P21蛋白定位于细胞质中,少量分布于细胞核中。结果表明AC16与P21相互作用的消失对AC16及P21的定位没有明显影响。为了检测AC16以及AC16与P21的相互作用对病毒杀虫活性的影响,分别用AcMNPV ac16缺失突变体 vAcac16ko-PH、ac16 缺失-异位回复突变体 vAcac16ko-rep-PH、AC16 AA90-100敲除突变体vAcac16Δ90-100-PH和野生型vAcPH病毒分别感染甜菜夜蛾幼虫,测定半数致死时间LT50。实验结果显示:以3×107 PIB/mL的病毒浓度饲喂感染二龄甜菜夜蛾幼虫,四种病毒突变体致使幼虫半数致死时间均为78h左右,不存在显著性差异。在杆状病毒中存在一些序列高度保守的基因,为探究这些高保守性同源基因之间能否实现功能替换,我们尝试利用β属的小菜蛾颗粒体病毒（Plutella xylostella Granulovirus,PlxyGV）的vp39和gran基因分别替代AcMNPV基因组中的vp39和polh基因,构建重组 bacmids vAcp39ko-Pxvp39-PH 和 vAcgran。vp39 和polh/gran 的编码产物分别是病毒衣壳的主要结构蛋白和包涵体蛋白。透射电镜观察结果显示:在vAcvp39ko-Pxvp39-PH转染96 h后的Sf9细胞中未观察到病毒衣壳;在vAcgran感染的细胞中有大量被囊膜包裹的核衣壳的存在,但未观察到明显包涵体,表明PlxyGV vp39、gran不能功能性替代AcMNPV vp39和polh。