论文部分内容阅读
目的:低血糖是糖尿病病人中十分常见的并发症,容易引起许多心血管事件。目前文献已报道高糖培养心肌细胞会造成心肌缝隙连接蛋白43（Connexin43,Cx43）的表达改变并引起细胞自噬功能增强。我们的研究将进一步揭示高糖后低糖培养H9c2细胞是否也会对Cx43及自噬功能造成影响。方法:将H9c2细胞在高糖（33.3mM葡萄糖浓度）培养基中培养24h后再换为低糖（2.5mM葡萄糖浓度）培养基分别继续培养2h,4h,6h或12h作为实验组（33.3-2.5mM,高糖后低糖组）。抑制剂组的培养方法与实验2小时组相同,仅在换为低糖培养基的同时,将氯喹（Chloroquine,自噬抑制剂）、U0126(MEK1/2抑制剂)或LY294002（PI3K抑制剂）分别加入到培养基中。对照组细胞单独在5.5mM,33.3mM,2.5mM葡萄糖浓度的培养基中培养24h,后仍换为原葡萄糖浓度的培养基分别继续培养2h,4h,6h或12h。另设置抑制剂对照组,即在5.5mM,33.3mM,2.5mM培养2h组中各自分别加入氯喹、U0126或LY294002三种抑制剂,以排除抑制剂自身造成的影响。设置甘露醇对照组排除渗透压变化造成的影响,即使用5.5mM葡萄糖浓度加27.8mM甘露醇浓度的培养基按上述方法培养作为甘露醇对照1组（mannitol 1）,甘露醇对照1组与33.3mM组的渗透压相同,与5.5mM组的葡萄糖浓度相同;使用2.5mM葡萄糖浓度加30.8mM甘露醇的培养基培养24小时后换为2.5mM葡萄糖浓度的葡萄酒再培养2h,4h,6h或12h为甘露醇对照2组（mannitol 2）,甘露醇对照2组与33.3-2.5mM组的渗透压变化相同,与2.5mM组的葡萄糖浓度相同。使用Western blot检测蛋白质的表达水平,流式细胞术检测细胞凋亡情况,MTT分析法检测细胞增殖能力,LDH试剂盒检测细胞毒性。结果:高糖后低糖培养增加了细胞的早期凋亡率及细胞毒性,同时降低了细胞的增殖能力。而抑制剂LY294002加入后使上述变化有所缓解,但氯喹和U0126使用后加剧了上述改变。高糖后低糖培养使心肌Cx43的表达随着培养时间延长显著下降,同时自噬相关蛋白LC3-II,Beclin-1,p62以及信号通路蛋白p-Akt,p-mTOR,p-ERK1/2的表达显著增加。氯喹抑制了自噬并使Cx43的表达上调;U0126抑制了ERK1/2的激活同时也抑制了自噬,但增加了Cx43的表达;LY294002抑制了p-Akt的表达,但激活了自噬,使Cx43的表达进一步下调。有意思的是,U0126使MEK1/2受到了抑制同时也造成了p-Akt的表达升高,但LY294002将PI3K抑制后却同时导致p-ERK的表达下调。结论:高糖后低糖培养使H9c2心肌细胞中自噬活性增加,从而造成Cx43的表达下调,且此时自噬由PI3K/Akt/mTOR和MEK/ERK1/2信号通路的交叉调节而激活。