肝纤维化(Hepatic fibrosis, HF)是多种慢性肝病发展至肝硬化的必经病理过程。肝纤维化时肝脏内部的力学环境会发生改变。肝窦内皮细胞(Sinusoidal endothelial cells, SECS)作为肝脏的微血管内皮细胞,在力学环境改变中起重要作用。黄芪作为芪术颗粒的君药之一,其具有补气、行滞等功效,抗肝纤维化,我们研究其主要有效成分黄芪多糖(Astragalus polysaccharide,APS)对培养状态下SECS的微区力学影响。利用实验室已建立的联合成像和测量系统,进行SECS的形貌及微区力学可视化观测并测量,结合以血流、血液和血管为基础研究对象的生物力药理学理论,从力学角度探讨黄芪抗肝纤维化的机制,从而为研究黄芪治疗以SECS损伤为模型的肝纤维化的生物力药理学研究奠定基础,为进一步研究通过改变SECS的结构与力学性质最终得以逆转肝纤维化奠定实验基础,为名老中医抗肝纤维理论内涵提供科学依据。本研究共分为以下四个部分：第一部分：SECS的原代培养及鉴定目的：本研究以SECS作为研究对象,首先要实现对SECS的分离、纯化和实现稳定的培养,为进一步的研究提供前提条件；同时利用免疫荧光法通过对SECS表面标志物CD14及Ⅷ因子相关抗原抗体的荧光染色,并利用环境扫描电子显微镜观察细胞的超微结构来对分离纯化后的SECS进行鉴定并验证期纯度。方法：在课题组前期分离培养的方法上进行改进,采用门静脉插管法,将大鼠肝脏原位的用D-Hanks液冲净血液,再利用Ⅳ型胶原酶原位灌注,Ⅳ型胶原酶、DNA酶灌注离体消化,离心洗涤出肝非实质细胞,进行Percoll密度梯度离心法分离出SECS,选用内皮细胞专用培养基原代培养SECS。将SECS经CD14及Ⅷ因子相关抗原抗体与一抗结合后,再与荧光二抗结合,并利用DAPI染细胞核,借助快速激光共聚焦荧光显微镜对SECS进行荧光染色的鉴定。将SECS固定、脱水、干燥后在低真空模式下运用环境扫描电镜观察细胞的超微结构。结果：实现了对SECS的分离和培养,部分细胞甚至实现了传代。光学显微镜下观察,SECS状态良好,在体外培养状态下细胞生长良好,形态典型,呈现出典型的从接种后的圆形向梭形的变形,并持续增殖。电子显微镜下观察,细胞有典型的由成簇窗孔组成的筛板样结构；同时观察到,随着培养时间的延长,胞质上的窗孔会减少和减小,随着细胞的变形和向外铺展,窗孔也从细胞核周围向外迁移。免疫荧光法鉴定CD14鉴定的阳性率约达99%,Ⅷ因子相关抗原抗体鉴定的阳性率约为2%。结论：本研究采用肝脏胶原酶原位灌注、离体消化结合percoll密度梯度离心法成功实现了SECS的分离和纯化,并筛选出一种适宜SECS的内皮细胞专用培养基；通过观察细胞的超微结构及CD14及Ⅷ因子相关抗原抗体荧光染色鉴定结果,证实了分离和培养SECS的成功,且SECS纯度是较高的。第二部分：不同浓度的黄芪多糖对SECS杨氏模量的影响目的：本研究以体外培养的SECS为研究对象,借助原子力显微镜(atomic force microscope, AFM)／快速激光共聚焦显微镜联合成像及测量系统,运用原子力显微镜力谱技术,实现对不同浓度黄芪多糖作用后24小时的SECS杨氏模量的测量,探讨SECS在不同浓度黄芪多糖干预后的微区力学响应,以明确不同浓度的黄芪多糖对SECS力学性质的影响。方法：研究分为空白组和实验组,其中空白组编号为1组：黄芪多糖Oμg/ml,实验组依黄芪多糖的浓度分为5组：编号为2组12.5μg/ml,3组25μg/ml,4组50μg/ml,5组100μg/ml,6组200μg/ml。依照实验分组,在接种后24小时的原代培养的SECS的培养基加入黄芪多糖溶液,并放置5%C02,37℃培养箱中培养24小时。借助原子力显微镜／快速激光共聚焦显微镜,以二氧化硅微球修饰的微悬臂为施力工具,对不同浓度黄芪多糖作用24小时后的SECS进行杨氏模量的测量,将得到的力曲线通过相关软件计算,利用SAS9.1软件统计其压人深度为300nnm的杨氏模量。结果：各实验组均得到40个力曲线,共计240个力曲线,统计后发现实验组各组杨氏模量均比空白组大,差异有统计学意义(P<0.05),黄芪多糖浓度从12.5ug/ml至200ug/ml的5个组,SECS杨氏模量值呈波动的上升趋势,低浓度的12.5ug/ml组及25ug/ml组与高浓度的200ug/ml组之间的差异有统计学意义(P<0.05)。而中间浓度的50ug/ml组及100ug/ml组与低浓度及高浓度之间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论：黄芪多糖作用24小时后,SECS的杨氏模量增大,即黄芪多糖能使SECS变“硬”,并且在实验浓度范围内,且SECS的“硬度”与黄芪多糖的浓度呈正相关关系。SECS变“硬”后,可能会对肝窦内血流阻力减小,从而对起到改善了肝脏的微循环的作用。第三部分：不同浓度的黄芪多糖对SECS铺展及窗孔的影响目的：本研究以体外培养的SECS为研究对象,利用环境扫描电子显微镜观察不同浓度的黄芪多糖对作用后24小时后对SECS细胞铺展及窗孔特点的影响,以明确不同浓度的黄芪多糖作用24小时后对SECS生理结构的影响。方法：同上,研究分为空白组和实验组,空白组编号为1组：黄芪多糖Oμg/ml,其中实验组依黄芪多糖的浓度分为5组,编号为2组:12.5μg/ml,3组:25μg/ml,4组:50μg/ml,5组:100μg/ml,6组:200μg/ml。依照实验分组,在接种后24小时的原代培养的SECS的培养基加入黄芪多糖溶液,并放置5%C02,37℃培养箱中培养24小时。将经黄芪多糖作用24小时后的SECS用戊二醛固定,然后使用乙醇浓度梯度脱水法脱水,再用临界点干燥仪通过C02临界点干燥法进行干燥。借助环境扫描电子显微镜在低真空模式下观察并采集图片。然后每组随机选取十个细胞,利用图片处理软件进行细胞面积及窗孔数据的采集,将采集的数据输入Excel表中,并利用SAS9.1进行统计分析。结果：观察到黄芪多糖作用24小时后,SECS的铺展面积呈波动的上升趋势,实验组均比空白组细胞面积铺展大,其中黄芪多糖25μg/ml组及200μg/m组与空白组之间差异有统计学意义(P<0.05)。黄芪多糖作用SECS24小时后实验组的窗孔均多于空白组,且实验组中随着黄芪多糖浓度的升高,窗孔的数目呈上升趋势,尤其是黄芪多糖较高浓度组100μg/ml组及200μg/ml组,窗孔数目均在空白组2倍以上。同时观察到黄芪多糖能使细胞上单个窗孔面积有变小,且随着黄芪多糖浓度的增加,单个窗孔面积有变小的趋势,黄芪多糖中高浓度组25μg/ml组,50μg/ml组,100μg/ml组,200μg/ml组与空白组之间的差异有统计学意义(P<0.05),低浓度组12.5μg/ml组与空白组之间差异无统计学意义(P>0.05)。但是窗孔数目的增加对总窗孔面积的影响大于大于单个窗孔面积的减小,也就是说,黄芪多糖作用于SECS24小时后能使细胞总窗孔面积增大。结论：黄芪多糖作用24小时后有利于培养状态下的SECS的铺展；黄芪多糖作用24小时后窗孔有积极影响,且与黄芪多糖浓度呈正相关关系。间接的验证了黄芪增加培养状态的SECS的总窗孔面积,改善肝窦毛细血管化,方便了SECS两侧的物质交流,从而起到抗肝纤维化作用。第四部分：黄芪多糖对SECS胞内NO合成的影响目的：一氧化氮(NO)是生物体内重要的第二信使和神经递质,对血管有舒张作用。本研究以体外培养的SECS为研究对象,利用快速激光共聚焦荧光显微镜,NO荧光探针,观察不同浓度的黄芪多糖对SECS合成NO的影响,以明确不同浓度的黄芪多糖对SECS生理功能的生物学影响。方法：首先,对培养状态下的SECS进行NO探针DAF-FM DA的安装。以PBS溶液为空白对照组,实验组依照黄芪多糖浓度分为黄芪多糖25μg/ml组及黄芪多糖50μg/ml组,借助快速激光共聚焦荧光显微镜/全内反射荧光显微镜联合成像系统,对安装了NO探针DAF-FM DA的SECS进行实时的荧光监测,按10秒/帧拍照,并在第500秒时加入PBS溶液或者黄芪多糖溶液,观察实验区域的平均荧光强度变化,并利用软件以时间为横坐标、平均荧光强度为纵坐标,将实验区域的平均荧光强度变化绘制成曲线图,以此判断黄芪多糖对SECS合成NO的影响。结果：可以看出,空白组从实验开始到实验结束的1500s中,实验区域的荧光强度呈下降趋势,下降幅度为5%左右,第500s时加入PBS溶液未对整个变化趋势产生影响。黄芪多糖25ug/ml组从实验开始到500S时,实验区域的平均荧光强度呈下降趋势,在加入的黄芪多糖之后,平均荧光强度迅速上升,上升幅度约15%,然后随着时间的延长平均荧光强度逐渐下降,到实验结束的1500s时,荧光强度基本恢复到加药前水平。黄芪多糖50ug/ml同样从实验开始到500S时,实验区域的平均荧光强度呈下降趋势,在加入黄芪多糖之后,平均荧光强度迅速上升,上升幅度约11%,然后随着时间的延长平均荧光强度逐渐下降,到实验结束的1500s时,荧光强度也基本恢复到加药前水平。结论：NO探测DAF-FM DA在荧光照射下可能有一定的淬灭；黄芪多糖使体外培养状态下的SECS内NO合成量迅速增加。SECS的合成NO增加,能起到扩张肝内血管,从而起到改善肝脏循环的作用。