手性氨基醇是一类具有光学活性的化合物,广泛地应用于手性药物合用和精细化工等领域。虽然合成手性氨基醇的化学工艺相对成熟,但是面临着生产工艺环境污染严重,反应条件严苛等弊端。相对于化学合成,生物合成更符合可持续发展理念 并且生物催化剂本身绿色且易制备。在生物合成中,相比于单酶反应,多酶级联反应 以将廉价底物转化为高附价值化合物,更大地发挥酶催化的优势和应用范围。本文构建了一个新型多酶级联反应体系,可将廉价易得的外消旋底物 氧苯乙烷转化为手性苯甘氨醇。该级联反应包括水解、氧化及转氨三个模块反应。(?)一模块中,环氧苯乙烷首先被环氧水解酶VrEH2突变体水解生成单一构型的苯乙(?);随后在第二模块中利用NAD+依赖型的甘油脱氢酶EaGDH完成苯乙二醇的氧化,同时偶联丙氨酸脱氢酶(AlaDH)实现该氧化步骤中辅酶NAD+再生;最后在第三模块中(?)用ω-转氨酶突变体ω-TAY150F/V153A,以L-丙氨酸作为氨基供体,完成2-羟基苯乙酮的安化。转氨步骤中的副产物丙酮酸在丙氨酸脱氢酶(AlaDH)的作用下被转化为丙氨酸,实现了氨基供体的再生,同时为氧化步骤提供辅酶NAD+。丙氨酸脱氢酶(AlaDH)将氧(?)反应与转氨反应偶联构建了级联反应内部辅酶循环体系,无需额外添加辅酶(NAD+和(?)ADH)和辅底物。本文分别对单一模块的反应条件进行研究,包括缓冲液类型和pH 研究结果表明三个模块反应都可以接受pH在7.5至8.5的范围,都可以接受使用磷(?)缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液和Tris-HCl缓冲液。在此基础上,在100 mM甘氨(?)氢氧化钠缓冲液,pH 8.0条件下,本文构建的多酶级联反应成功实现了环氧苯乙烷到 甘氨醇的转化,最终得到8.1mM的苯甘氨醇,目标产物得率为40.5%,ee值为99%,中间产物苯乙二醇占总产物的59.1%。通过比较级联反应正逆反应各组分的含量,推(?)出级联反应中存在平衡问题,导致中间产物苯乙二醇的积累。最后,为降低中间产物的积累,推动级联反应朝生成氨基醇的方(?)进行,本文设计了一个偶联产物原位吸附的反应器,利用阳离子交换树脂原位选择性(?)附产物(R)-苯甘氨醇,可以推动级联反应平衡向生成氨基醇的方向进行,实现终产物(?)甘氨醇的含量由40.5%提升至81.9%,中间产物的含量减少至16.5%。这些结果表明多(?)级联反应可有效将环氧苯乙烷转化为手性苯甘氨醇,并且产物原位吸附能够进一步降低中间产物的积累,提高终产物的得率。