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脂肪肝是围产期奶牛常见的能量代谢紊乱性疾病,我国围产期奶牛脂肪肝发病率在25%-50%。奶牛脂肪肝发生的关键环节是甘油三酯(TG)在肝细胞中的过度蓄积。内质网(ER)作为脂质合成及多种脂代谢酶的定位场所,其内环境的平衡对于肝细胞脂质代谢稳态的维持至关重要。肝细胞受到异常脂代谢信号刺激会引起ER稳态的破坏,即内质网应激(ERS),ERS能加剧肝细胞脂质的合成。固醇调节元件结合蛋白(SREBP-1c)是ER上合成的关键脂合成转录因子,受其调控的靶基因包括乙酰辅酶A羧化酶α(ACACA)、脂肪酸合酶(FASN)和二酯酰甘油酰基转移酶(DGAT)等,这些酶直接参与脂质的合成,是脂合成的限速酶,在肝细胞脂代谢稳态的调节中发挥至关重要的作用。新合成的SREBP-1c是一种无活性的前体SREBP-1c(p SREBP-1c),必须经过一系列加工才能形成有活性的核SREBP-1c(n SREBP-1)。人和小鼠脂肪肝的研究表明,ERS可以上调SREBP-1c的表达、成熟及其下游脂合成相关基因的表达,从而促进脂蓄积。然而,脂肪肝奶牛肝脏ERS的状态、ERS对SREBP-1c的调节作用和它们在奶牛肝脂沉积中的调节机制尚未明确。本研究通过检测重度脂肪肝奶牛和健康奶牛肝脏ERS标志分子、p SREBP-1c、n SREBP-1c和脂合成关键基因的表达,明确重度脂肪肝奶牛肝脏ERS和脂合成状态。结果显示,重度脂肪肝奶牛肝脏蛋白激酶RNA样内质网激酶(PERK)、激活转录因子6(ATF6)和肌醇需要酶1α(IRE1α)被激活,且ERS伴侣分子葡萄糖调节蛋白78(GRP78),激活转录因子4(ATF4)和剪接型X盒结合蛋白(s XBP1)的表达显著高于健康奶牛,说明重度脂肪肝奶牛肝脏存在ERS。此外,重度脂肪肝奶牛肝脏p SREBP-1c和n SREBP-1c的蛋白表达及ACACA、FASN和DGAT1的m RNA表达显著高于健康奶牛,说明重度脂肪肝奶牛肝脏脂合成通路被激活。为明确ERS在脂肪酸(FFA)诱导的奶牛肝脂蓄积中的作用,我们在体外培养的奶牛肝细胞中添加FFA和ERS抑制剂牛磺熊去氧胆酸(TUDCA),并检测ERS和脂代谢相关指标。结果显示,FFA可以诱导奶牛肝细胞ERS,促进p SREBP-1c、n SREBP-1c的蛋白表达及其靶基因ACACA、FASN和DGAT1的m RNA表达以及脂质蓄积,而ERS抑制剂TUDCA可以缓解这些作用,说明FFA可以通过诱导ERS来上调SREBP-1c的表达和成熟,从而促进脂合成关键基因的表达以及脂质蓄积。鉴于重度脂肪肝奶牛伴随着血液中高浓度的FFA、慢性ERS的发生以及p SREBP-1c和n SREBP-1c的高表达,我们推测ERS可以通过上调SREBP-1c的表达和成熟参与奶牛脂肪肝的发生发展。p SREBP-1c水解成熟的过程受到ER膜蛋白胰岛素诱导基因1(Insig-1)和固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SCAP)的调节。为了明确Insig-SCAP-SREBP-1c是否参与ERS诱导的奶牛肝细胞脂质蓄积,我们在体外培养的奶牛肝细胞中转染Insig-1过表达质粒并添加ERS经典诱导剂衣霉素(TM),然后检测SREBP-1c的成熟及脂合成相关指标。结果显示,TM下调奶牛肝细胞Insig-1的蛋白表达并上调SCAP、p SREBP-1c和n SREBP-1c的蛋白表达和TG含量,而过表达Insig-1抑制TM上调的n SREBP-1c的蛋白表达及其靶基因ACACA、FASN和DGAT1的m RNA表达和TG含量。这表明,ERS可以通过下调Insig-1的蛋白表达来促进奶牛肝细胞中SCAP-SREBP-1c复合体的转运以及SREBP-1c的水解成熟,从而促进脂合成关键基因的表达,最终诱导脂蓄积。脂肪肝奶牛发生ERS的主要诱因是高浓度的FFA。因此,为了明确ERS及其下游通路Insig-1-SCAP-SREBP-1c是否介导了FFA引起的肝脂蓄积,我们在FFA处理的奶牛肝细胞中进行验证。结果表明,FFA可通过诱导ERS下调Insig-1的蛋白表达,从而促进SREBP-1c的水解成熟及其靶基因的表达,最终诱导奶牛肝细胞的脂质蓄积。有趣的是,我们的研究发现TM和FFA均可上调p SREBP-1c的表达,但过表达Insig-1不影响TM或FFA上调的p SREBP-1c的蛋白表达,说明ERS或FFA对奶牛肝细胞p SREBP-1c蛋白表达的上调不依赖于Insig-1。随后脂肪肝奶牛肝脏回归验证试验显示,重度脂肪肝奶牛肝脏Insig-1蛋白表达显著降低,而SCAP蛋白表达显著增加,这些体内结果说明重度脂肪肝奶牛肝脏Insig-1-SCAP-SREBP-1c转运体系被激活。综上所述,ERS激活的Insig-1-SCAP-SREBP-1c转运体系参与FFA诱导的奶牛肝细胞脂蓄积。重度脂肪肝奶牛存在高FFA血症,肝脏存在ERS且Insig-1-SCAP-SREBP-1c转运体系被激活。因此,我们推测围产期奶牛的高FFA血症引起肝细胞ERS,进而下调Insig-1的蛋白表达,促进SCAP-SREBP-1c复合体的转运,从而上调n SREBP-1c及其下游脂合成关键基因的表达,最终导致奶牛肝脏脂质蓄积。这些结果为揭示奶牛脂肪肝肝脂沉积的分子机制奠定了实验和理论基础,为将来研发靶向ERS的奶牛脂肪肝的防治制剂奠定了技术基础。但是,ERS通过Insig-1-SCAP-SREBP-1c转运体系促进奶牛脂肪肝发生发展这一观点还需更多体内实验结果来支撑。