目的:据2018年疟疾报告显示,2017年全世界仍有2.19亿人感染疟疾,并有43.5万人因疟疾死亡。世界卫生大会批准了《2016-2030年全球疟疾技术战略》,该策略呼吁到2030年全球疟疾发病率和死亡率将至少减少90%。这一宏伟的计划应消除所有类型的疟疾感染,包括严重和复杂的,轻度的以及隐性感染。虽然现阶段疟疾的控制手段是有效的,然而杀虫剂和抗疟药物抗性的出现以及无症状疟原虫携带者的隐性传播给疟疾的控制和消除带来了极大的威胁。面临这些挑战,为实现彻底消灭疟疾的宏伟计划,疫苗无疑成为最为有效的策略。而与其它疟疾疫苗候选抗原相比,传播阻断疫苗（TBVs）候选抗原表达在疟原虫有性阶段膜表面,因不受人体宿主免疫的压力,抗原多态性有限。因此在流行区,TBVs是阻止各种感染类型的疟原虫从蚊媒向人类传播的最有效手段。然而,TBVs的研制依然缓慢,尤其对间日疟TBVs的研发更为滞后。而且实验证据表明,不是所有的同源基因都能在相应的种属发挥重要的作用。本文在明确无症状疟疾感染严重的流行程度的前提下,通过生物信息学分析,筛选未知功能的疟原虫有性阶段候选抗原,进一步确定其分子结构、表达阶段、传播阻断活性和生物学功能,以便开发用以彻底消除疟疾的更安全高效的TBVs。我们以中缅边境缅甸一侧拉咱镇为调查地点,分别于疟疾感染高发前期、高发期及高发后期,针对流行区人群进行横断面研究。通过分子检测方法确定无症状疟疾感染及配子体携带的流行特点。接着,我们应用鼠疟-伯氏疟原虫做初步筛选,从疟原虫数据库中选择在有性生殖阶段表达的膜表面蛋白PBANKA₁45910（Pb61）,截取其优势抗原表位区域,通过直接免疫重组蛋白后的血清抗体验证所选蛋白的抗原性和免疫原性,通过免疫学实验技术确定Pb61在伯氏疟原虫的表达特点,通过体内外实验验证Pb61的传播阻断效果。进一步通过双交叉同源重组方法获得ΔPb61虫株,对ΔPb61的生长发育进行了详细的表型分析与生物学功能的研究,明确Pb61基因对疟原虫整个生活史的影响,为确定新型传播阻断疫苗的候选靶点或抗疟药物靶点提供理论依据。研究方法:1、公式法估计样本含量。单纯随机抽样的样本数目计算公式:n=（μ²）（π）（1-π）/δ²,以边境疟疾流行率（π）为20%,μ作为95%可信区间（CI）的统计量为1.96和误差（δ）为2%估计样本含量。2、nRT-PCR鉴定无症状疟疾感染。巢式聚合酶链式反应（nRT-PCR）是基于18S rRNA基因进行的,所检测人类疟疾类型包括恶性疟、间日疟、卵形疟和三日疟。3、qRT-PCR鉴定无症状间日疟配子体的携带情况。应用特异性表达在间日疟配子体表面的蛋白Pvs25的特异性引物,通过TaqMan探针法定量PCR对间日疟阳性样本进一步鉴定所携带配子体的含量。4、生物信息学分析。在PlasmoDB网站上获取未知功能的PBANKA₁45910（Pb61）基因序列;应用生物信息学分析软件进行同源性分析,预测Pb61的结构域、信号肽、跨膜区和抗原表位,以确定Pb61截短蛋白的表达区域。5、rPb61蛋白的表达与纯化鉴定。以伯氏疟原虫gDNA为模板扩增目的片段,通过载体构建系统获得pET32a-Pb61表达载体。将鉴定成功的pET-32a（+）-Pb61的菌种经IPTG诱导表达rPb61。利用亲和层析法纯化rPb61重组蛋白,再次经SDS-PAGE及Western blot方法确定蛋白大小。6、Pb61免疫血清特异性抗体的检测。rPb61与弗氏佐剂混合后经皮下注射免疫雌性BALB/c小鼠,以溶解rPb61的PBS作为对照。于第一次免疫后的14、28、42天,收集血清。以伯氏疟原虫的全虫蛋白为抗原,通过ELISA和Western blot方法验证rPb61血清抗体效价及其免疫原性。7、qRT-PCR检测Pb61mRNA的转录水平。按组织RNA提取试剂盒说明书提取P.berghei裂殖体、配子体与动合子的总RNA,通过逆转录获得cDNA。用qRT-PCR方法检测Pb61 mRNA在疟原虫裂殖体、配子体和动合子阶段的转录水平。8、IFA确定Pb61的表达特点。各阶段疟原虫,经0.1%Triton X-100透膜处理及不处理后,分别孵育抗rPb61鼠血清及Alexa Fluor488标记的抗鼠IgG（抗PBS鼠血清作阴性对照）。DAPI染色后经抗淬灭封片剂封片,荧光显微镜观察结果。9、应用同源重组技术获得Pb61HA标签型疟原虫。将鉴定正确的Pb61HA打靶质粒线性化并抽提,将线性化的Pb61-HA tag质粒电转染至纯化的裂殖体内,经小鼠尾静脉注射于体内培养。乙胺嘧啶药筛后,对耐药株进行单克隆,并通过PCR和Western blot方法鉴定Pb61-HA tag型疟原虫虫株。10、Western blot检测Pb61-HA的表达特点。纯化的野生型和标签型裂殖体、配子体与动合子蛋白分别经SDS-PAGE电泳分离;经抗HA tag兔抗体与转有各期抗原的PVDF膜反应,确定Pb61蛋白的表达阶段。野生型和标签型细胞核、细胞器、细胞质及质膜蛋白经SDS-PAGE分离;同样经抗HA tag兔抗体与各抗原反应,确定Pb61蛋白的表达特点。11、Pb61体内外传播阻断效果的验证。体外,小鼠血液与动合子培养基1:4混合（含有稀释的rPb61/对照免疫的小鼠抗血清:1:5/1:10/1:50）,培养后光学显微镜下观察出丝情况;小鼠血液与动合子培养基1:9混合（含有同样稀释的实验组和对照组抗血清）,培养后Giemsa染色经光学显微镜下计数各组动合子形成数量。体内,三次免疫后的实验组（rPb61）和对照组（PBS）小鼠,腹腔注射伯氏疟原虫。感染后第4天,各组小鼠经饥饿的雌性按蚊充分叮咬。吸血10天后解剖雌性按蚊并比较蚊胃中卵囊的数量。12、应用同源重组技术获得ΔPb61型疟原虫。将鉴定正确的ΔPb61型打靶质粒线性化并抽提,将线性化的ΔPb61质粒电转染至纯化的裂殖体内,经小鼠尾静脉注射于体内培养。经乙胺嘧啶药筛后,对耐药株进行单克隆,并通过PCR、RT-PCR及Western blot方法鉴定ΔPb61型疟原虫虫株。13、敲除型（ΔPb61）与野生型（WT）疟原虫基因功能的比较。分别用ΔPb61型和野生型疟原虫经腹腔注射感染BALB/c雌性小鼠,每组5只。从感染后第3天开始计数原虫血症、配子体血症与雌雄配子体比率并每天记录小鼠的生存情况。体外于感染后第2天开始,连续7天动态观察配子体出丝情况;同时于感染后第3天,体外培养动合子计数,并通过直接膜饲实验比较体内动合子及卵囊形成的数量。14、统计分析。应用GraphPad Prism 6.0和SPSS Statistics 19.0统计软件对数据进行处理和统计分析,P<0.05表示有统计学差异。结果:1、样本量的确定。根据公式计算出样本量至少为1537例,而实际样本量为1680例,包括在高峰前期（n=516）、高峰期（n=578）和高峰后期（n=586）。2、中缅边境无症状间日疟感染呈高水平流行且间日疟配子体携带率较高。针对18s rRNA的nRT-PCR结果显示大部分的疟疾感染是无症状的亚显微镜感染,感染率达到23.4%。无症状间日疟为主要流行的隐性疟疾类型,占到全部感染类型的89.6%,经qRT-PCR证实55.5%间日疟感染者携带配子体。3、成功克隆、表达和纯化rPb61。通过上述生物信息学分析确定Pb61截短蛋白为284aa-384aa。成功构建pET32a-Pb61质粒,并转化到E.coli表达菌株BL-21中,大量表达的重组蛋白经His-tag镍氨三乙酸琼脂糖柱纯化。SDS-PAGE和Western blot结果均显示获得高纯度的大小约31kDa的重组蛋白。4、成功获取高效价rPb61免疫特异性血清抗体。ELISA结果显示,Pb61三次免疫后的抗体水平(OD_{490 nm})明显高于对照组;rPb61免疫小鼠获得血清抗体滴度达到1:6400。Western blot结果显示,rPb61免疫血清可特异性识别⁶1 kDa的条带,说明Pb61具有良好的免疫原性。5、Pb61基因mRNA主要在有性阶段转录。qRT-PCR结果显示,以裂殖体作为参照时,Pb61基因的mRNA在配子体和动合子阶段的转录水平要显著高于裂殖体阶段,提示Pb61基因主要在有性阶段进行mRNA的转录。6、成功获得Pb61-HA tag型疟原虫。经乙胺嘧啶药物选择后,获取了耐药型的Pb61-HA tag型疟原虫,经克隆传代后,PCR鉴定结果和Western blot均显示成功获得了在Pb61末端加入HA标签的伯氏疟原虫。7、Pb61主要在配子体和动合子的膜表面表达。经0.1%TritonX-100透膜与非透膜的IFA结果显示,Pb61表达于疟原虫发育的各个阶段,而主要表达于配子体阶段的细胞质和膜表面以及受精后期阶段的膜表面。Western blot分析显示,Pb61HA在疟原虫裂殖体、配子体和动合子均有表达,且于配子体的细胞核、细胞质和质膜上表达,主要表达在配子体的膜表面。8、rPb61抗血清能够明显抑制蚊体阶段疟原虫的发育。体外实验结果显示,抗rPb61的小鼠血清能够抑制疟原虫雄配子出丝,24h后动合子形成数量减少,且抑制效果呈抗体剂量依赖性。体内三次独立实验结果显示,与对照组相比蚊感染率下降不明显,但卵囊数量分别减少了54.53%、56.26%和36.85%,差异均具有统计学意义。9、成功获得ΔPb61型疟原虫。通过乙胺嘧啶阳性筛出ΔPb61型疟原虫,经克隆传代后,PCR、qRT-PCR及Western blot的结果均显示成功得到了Pb61基因敲除型的疟原虫。10、Pb61缺失影响雄性配子的发育。与WT相比,ΔPb61疟原虫红细胞感染率及小鼠生存率无差别;配子体数量及雄雌配子体比例无明显变化,而雄配子的发育完全受到抑制,体内外动合子未形成,蚊胃中也未发现卵囊。结论:1、无症状感染是疟疾持续传播的重要来源。2、Pb61主要表达在有性阶段的膜表面。3、rPb61免疫血清具有良好的免疫原性和显著的传播阻断效果。4、Pb61是雄配子发育阶段的关键基因。