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第一部分吗啡对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的线粒体保护作用机制目的:探讨吗啡是否通过抑制线粒体通透性转移孔（mitochondrial permeability transition pore,m PTP）开放减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤,并探讨其可能的细胞内信号转导机制。方法:应用Langendorff装置制备大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤模型（稳定20分钟、缺血30分钟、再灌注120分钟）。随机分为对照组、吗啡组和m PTP开放剂/抑制剂组。Powerlab数据采集分析系统进行心功能指标测定,分别为心率（heart rate,HR）、冠脉流量（coronary flow,CF）、舒张末期压力（end diastolic pressure,EDP）、左心室发展压（left ventricular developed pressure,LVDP）。离体心脏再灌注120分钟,结扎冠状动脉,TTC染色法（线粒体琥珀酸脱氢酶反应实验）检测心肌梗死面积;再灌注5分钟,取左心室危险区心肌组织,差速离心法提取心肌细胞线粒体,分光光度法进行钙离子诱导的线粒体肿胀实验以检测m PTP开放程度;再灌注5分钟、10分钟,取危险区心肌组织,Western blotting法检测糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β）和蛋白激酶B（protein kinase B,PKB或AKT）的磷酸化情况。结果:1吗啡对心功能的影响与对照组相比,再灌注时给予吗啡,HR没有统计学差异（P﹥0.05）。而CF,EDP,LVDP差异具有统计学意义（P<0.05）,说明吗啡能够改善再灌注心肌收缩功能。2吗啡对心肌梗死面积的影响与对照组相比,再灌注时给予吗啡能够明显减少心肌梗死面积,吗啡的抗梗死作用被m PTP开放剂苍术苷（Atractyloside）所逆转,差异具有统计学意义（P<0.05）,说明吗啡通过抑制m PTP开放发挥再灌注心肌保护作用。3吗啡对m PTP开放的影响对照组心肌细胞线粒体在520 nm吸光度明显减少,与对照组相比,再灌注时给予吗啡能够模拟m PTP抑制剂环孢菌素A（Cyclosporin A,Cs A）,明显抑制520 nm吸光度的减少,差异具有统计学意义（P<0.05）,说明吗啡能够抑制心肌细胞m PTP的开放。4吗啡对再灌注GSK-3β磷酸化的影响与对照组相比,吗啡能够明显增加再灌注5分钟、10分钟GSK-3β的磷酸化,差异具有统计学意义（P<0.05）,说明吗啡通过使GSK-3β失活保护再灌注心脏。5吗啡对再灌注AKT磷酸化的影响与对照组相比,吗啡能够明显增加再灌注5分钟、10分钟AKT的磷酸化,差异具有统计学意义（P<0.05）,说明吗啡通过激活AKT信号通路保护再灌注心脏。结论:吗啡通过激活AKT信号使GSK-3β失活,进而抑制m PTP开放发挥再灌注心肌保护作用。第二部分吗啡对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的内质网应激机制目的:探讨吗啡是否通过抑制内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ER stress）减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤,并探讨其可能的细胞内信号转导机制。方法:应用Langendorff装置制备大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤模型（稳定20分钟、缺血30分钟、再灌注120分钟）。随机分为假手术组（sham）、缺血/再灌注组（ischemia/reperfusion,I/R）、ER stress抑制剂牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）组和吗啡组。于缺血期和再灌注期不同时间点分别取左心室危险区心肌组织,Western blotting法检测ER stress伴侣分子葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein78,GRP78）的表达;再灌注期分别给予ER stress抑制剂TUDCA和吗啡,Western blotting法检测GRP78蛋白的表达;离体心脏再灌注120分钟,结扎冠状动脉,TTC染色法（线粒体琥珀酸脱氢酶反应实验）检测心肌梗死面积。结果:1心肌缺血对ER stress的影响与假手术组相比,心肌缺血30分钟,没有明显改变ER stress伴侣分子GRP78的表达,说明心肌缺血没有诱发ER stress。2心肌再灌注对ER stress的影响与假手术组相比,心肌再灌注120分钟,ER stress伴侣分子GRP78的表达明显增加,差异具有统计学意义（P<0.05）,说明心肌再灌注诱发ER stress。3吗啡对ER stress的影响与假手术组相比,再灌注期ER stress伴侣分子GRP78的表达明显增加,再灌注时给予吗啡能够模拟ER stress抑制剂TUDCA,使ER stress伴侣分子GRP78的表达明显减少,差异具有统计学意义（P<0.05）,说明吗啡能够抑制再灌注诱发的ER stress。4吗啡对心肌梗死面积的影响与对照组相比,再灌注时给予吗啡能够模拟ER stress抑制剂TUDCA,明显减少心肌梗死面积,差异具有统计学意义（P<0.05）,说明吗啡通过抑制ER stress发挥再灌注心肌保护作用。结论:ER stress发生于心脏再灌注期而不是缺血期,吗啡通过抑制ER stress保护再灌注心脏。第三部分锌离子介导内质网-线粒体“对话”参与吗啡的心肌保护作用目的:探讨锌离子(Zn2+)是否参与吗啡减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤的作用,并探讨其可能的内质网-线粒体“对话”机制。方法:应用Langendorff装置制备大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤模型（稳定20分钟、缺血30分钟、再灌注120分钟）。随机分为假手术组（Sham）、缺血/再灌注组（ischemia/reperfusion,I/R）、吗啡组和吗啡+锌离子螯合剂TPEN组。再灌注期给予吗啡和锌离子螯合剂TPEN,取左心室危险区心肌组织,Western blotting法检测ER stress伴侣分子GRP78蛋白的表达;取再灌注心肌组织,进行免疫荧光化学染色,异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）标记GRP78,碘化丙啶（propidium iodide PI）标记细胞核,激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope,CLSM）观察绿色和红色荧光强度变化;再灌注心肌组织,4%戊二醛固定,透射电镜观察心肌细胞超微结构;再灌注心肌组织,4%福尔马林溶液固定,苏木素-伊红染色（haematoxylin-eosin staning,HE染色）,观察心肌形态学变化。大鼠胚胎心脏组织来源H9c2细胞株的常规培养,线粒体特异性荧光探针四甲基罗丹明乙酯（tetramethylrhodamine ethyl ester,TMRE）染色,共聚焦显微镜观察线粒体红色荧光强度的变化,以检测线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,?Ψm）改变,进而确定m PTP开放程度;H9c2细胞用锌离子特异性荧光探针Newport Green DCF染色,激光扫描共聚焦显微镜观察绿色荧光强度的变化以检测细胞内游离锌离子的产生情况。结果:1吗啡对再灌注诱发ER stress的影响与假手术组相比,再灌注使ER stress伴侣分子GRP78的表达明显增加,再灌注时给予吗啡能够使ER stress伴侣分子GRP78的表达明显减少,吗啡的作用被锌离子螯合剂TPEN所抑制,差异具有统计学意义（P<0.05）,说明吗啡通过锌离子抑制再灌注诱发的ER stress。2吗啡对再灌注期GRP78荧光强度的影响与假手术组相比,缺血/再灌注使ER stress伴侣分子GRP78的绿色荧光强度明显增加,再灌注期给予吗啡能够明显抑制GRP78绿色荧光强度,吗啡的作用被锌离子螯合剂TPEN所抑制,差异具有统计学意义（P<0.05）。此结果与Western蛋白表达结果相一致,进一步说明吗啡通过锌离子抑制再灌注诱发的ER stress。3吗啡心肌超微结构的影响与假手术组相比,缺血/再灌注使心肌细胞线粒体和内质网损伤,包括线粒体肿大、双层膜结构破裂、嵴断裂、溶解或消失;内质网扩张、脱颗粒等。再灌注时给予吗啡能够明显减少线粒体和内质网损伤,吗啡的心肌细胞保护作用被锌离子螯合剂TPEN所抑制,说明吗啡通过锌离子保护再灌注心肌细胞。4吗啡对心肌组织形态学的影响与假手术组相比,缺血/再灌注使心肌纤维间隙增宽、排列紊乱、断裂等,再灌注时给予吗啡能够明显减少心肌纤维损伤,吗啡的作用被锌离子螯合剂TPEN所抑制,说明锌离子介导吗啡的再灌注心肌保护作用。5吗啡对心肌细胞m PTP开放的影响与0分钟基础值相比,20分钟后H9c2心肌细胞TMRE红色荧光强度无明显改变;H2O2处理细胞20分钟后,TMRE红色荧光强度明显减少,说明氧化应激能够使心肌细胞线粒体膜电位减少,由于线粒体膜电位的减少是m PTP开放的象征,此结果提示氧化应激使m PTP开放;ER stress诱导剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose,2-DG）能够模拟H2O2,使TMRE红色荧光强度明显减少,说明ER stress使m PTP开放;ER stress抑制剂TUDCA能够明显抑制TMRE红色荧光强度的减少,说明抑制ER stress可以阻止m PTP开放;吗啡能够模拟TUDCA、Zn Cl2、Cyclosporin A,明显抑制TMRE红色荧光强度的减少,吗啡的作用被锌离子螯合剂TPEN所抑制,差异具有统计学意义（P<0.05）,充分说明吗啡通过锌离子抑制m PTP的开放。6吗啡对心肌细胞m PTP开放的相关信号转导机制与H2O2处理细胞20 min相比,吗啡预处理能够明显抑制线粒体TMRE红色荧光强度的减少,吗啡的作用被AKT抑制剂AKTI及持续激活型GSK-3β转染质粒S9A所抑制,差异具有统计学意义（P<0.05）,说明吗啡通过AKT/GSK-3β信号抑制m PTP的开放。7吗啡对心肌细胞锌离子产生的影响与0分钟基础值相比,10分钟后H9c2心肌细胞Newport Green DCF绿色荧光强度无明显改变;Zn Cl2处理细胞10分钟后,Newport Green DCF绿色荧光强度明显增加,说明细胞内游离锌离子增多;ER stress抑制剂TUDCA和吗啡能够模拟Zn Cl2,使Newport Green DCF绿色荧光强度明显增加,吗啡的作用被锌离子螯合剂TPEN所抑制,差异具有统计学意义（P<0.05）,说明吗啡通过增加细胞内锌离子抑制ER stress。结论:吗啡通过增加细胞内锌离子含量,抑制ER stress进而阻止m PTP开放,发挥再灌注心肌保护作用,AKT/GSK-3β信号通路可能是线粒体-内质网“交叉对话”的重要机制。