论文部分内容阅读
目的:1.探索大鼠脑震荡后各部位病理变化规律。
2.评价单纯NGF与NGF+高压氧对实验性脑震荡大鼠的治疗效果并检测凋亡基因Bcl-2、Bax、Nf200蛋白表达与轴突计数的变化关系。
方法:健康Spague-Dawley(SD)大鼠110只,体重280±10g,雌雄不限(昆明医学院动物科提供)。采用自制单摆式颅脑损伤仪复制大鼠脑震荡模型。根据预实验结果,在砝码为150g,单摆杆与竖直线呈120°~135°时能成功复制大鼠脑震荡模型。采用目前通用大鼠脑震荡模型评价标准来衡量:①撞击后即刻出现一过性呼吸暂停,但不超过20s:②出现短暂的角膜反射、针刺疼痛反应、外耳道刺激反应消失,但不超过3min:③意识恢复后无运动障碍和反射异常:④影像学检查无颅内出血;⑤全脑肉眼无明显损伤改变。打击85只动物成功复制脑震荡大鼠75只,成功率为88.2%。将成功复制的脑震荡大鼠随机分为3组,每组25只,每组每个时相点5只动物(n=5)。A组动物25只,为正常对照组,每天每只大鼠给予生理盐水0.2ml腹腔注射;B组为致伤组,给予相同量的生理盐水腹腔注射;C组为单纯NGF治疗组,每天经腹腔注射含1ugNGF的注射用水;D组为联合治疗组,每天以相同方式给予相同量的NGF并行高压氧治疗,压力为2.0ATA,升压及降压各20~30min,稳压60min,每日1次;治疗总时间为三周。分别在1天、3天、1周、2周、3周各时相点取各组大鼠灌注取脑,制备标本,石蜡切片。分别行HE染色和免疫组化SP法检测Bcl-2、Bax基因、Nf200蛋白。显微镜下观察并记录神经元形态改变,病理图文系统分析凋亡细胞数量、凋亡基因Bcl-2、Bax蛋白的阳性细胞数、Nf200及神经轴突的数量,用SPSS13.0统计软件进行分析。
结果:
1.病理观察结果:致伤组各部位均见脑血管扩张、淤血,脑组织水肿、疏松,神经元胞体萎缩,胞浆嗜酸性,胞核形状不规则,可见坏死,神经元尼氏体减少。海马区主要以锥体细胞多见,严重者颗粒细胞亦变性:脑干部位主要以神经轴索病变为主。病变呈随时间变化的动态变化过程。
2.神经凋亡研究:各组与对照组同部位比较凋亡细胞数显著升高(p<0.01),且于致伤后3d后达到高峰;单纯NGF治疗组、联合治疗组与致伤组比较不同时相点凋亡细胞数均减少,在不同时相点均具有统计学意义(p<0.05);联合治疗组与单纯NGF治疗组之间比较凋亡细胞数有所减少,且在时相点1w时有统计学意义(p<0.05)。
3.免疫组化研究结果:各组脑组织中Bax、Bcl-2凋亡蛋白均有阳性表达。在致伤组,Bax在伤后3d、Bcl-2在伤后1d表达达高峰,以后逐渐减少,但仍高于对照组(p<0.05);Bcl-2/Bax阳性细胞比值明显低于对照组,与对照组间有显著性差异(p<0.01),在伤后3d达到最低谷。致伤后脑干、小脑等部位凋亡蛋白于伤后1d达到高峰,而海马、大脑凋亡蛋白在损伤3d后达到高峰,以后逐渐减少。致伤后大脑、海马凋亡蛋白Bax增多较小脑、脑干凋亡蛋白增多更明显,大脑、海马阳性细胞数与脑干、小脑阳性细胞数比较有统计学差异(p<0.05),而大脑与海马、脑干与小脑阳性细胞比较无统计学意义(p>0.05)。Bcl-2在致伤组伤后1d表达达到高峰,在单纯NGF治疗组2w表达达高峰;Bax凋亡蛋白在致伤组脑干、小脑、海马1d即达到高峰,在大脑3d达峰,以后呈逐渐降低趋势,在单纯NGF治疗组有所降低,但与对应致伤组比较无明显统计学意义(p>0.05)。联合治疗组与单纯NGF治疗组比较,Bcl-2阳性细胞显著增高,在1w时有统计学差异(p<0.05),Bax阳性细胞低于对应单纯NGF治疗组,在治疗第2w后有统计学差异(p<0.05)。而在两治疗组均能发现:海马、大脑与脑干、小脑之间比较凋亡蛋白Bcl一-显著增加,Bax显著减少,Bcl-2在治疗后1w有统计学意义(p<0.05),Bax在治疗2w以后有统计学差异(p<0.05),而脑干与小脑比较、海马与大脑比较两指标均无统计学差异(p>0.05)。
4.对照组Nf200阳性纤维均匀分布、排列规则。致伤组可见散在、不均的NE200,随时间推移神经纤维表达情况逐渐稀疏,在1w时与对照组比较有统计学意义(p<0.05)。治疗组神经纤维生长情况良好,在单纯治疗组2w、3w出现明显增长,轴突计数与致伤组比较有统计学意义(p<0.05),在联合治疗组1w时即出现显著性增长,与致伤组比较有统计学意义(p<0.05)。
结论:
1.大鼠实验性脑震荡后各部位脑组织存在病理形态学改变,并非传统中认为的是脑功能一过性障碍而无器质性损害,也并非单纯的类弥漫性轴索损伤可以解释。脑震荡主要以血液循环障碍和实质细胞变性、凋亡和坏死为主要病理改变,神经细胞凋亡是脑震荡神经元迟发性损害的主要形式之一。
2.HBO+NGF与单纯NGF治疗脑震荡均能减少神经细胞凋亡,单纯NGF组自第2w开始能明显抑制神经细胞的迟发性死亡。HBO+NGF联合治疗自第1w即能明显抑制神经细胞的凋亡。联合治疗组较单纯治疗组能提前、大幅度减轻神经细胞的迟发性死亡,足疗程(>1w)的HBO+NGF治疗脑震荡效果优于单纯NGF治疗。
3.单纯NGF治疗脑震荡可以通过改变凋亡基因的表达抑制脑震荡后神经细胞凋亡过程,其主要是通过增加抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达,抑制脑震荡后神经细胞凋亡,而对凋亡蛋白Bax的影响较小。NGF+HBO联合治疗脑震荡,既能增加抑凋亡蛋白Bcl-2的表达,又能明显抑制Bax的表达,能较强的抑制脑震荡后神经细胞凋亡。
4.脑震荡后大脑、海马更容易发生迟发性神经细胞的迟发性死亡,这也可以解释脑震荡后患者容易发生呕吐、睡眠障碍、植物神经功能失调、记忆力障碍等一系列脑震荡后综合症的病理生理学机制。而单纯NGF与NGF+HBO两种治疗手段对脑震荡后易损伤部位海马、大脑的保护作用更加明显,有利于减轻脑震荡后综合症的发生。
5.大鼠实验性脑震荡后通过单纯NGF治疗及HBO+NGF治疗神经元轴突能明显发生出芽和再生,表明神经元在脑震荡后通过治疗可以发生可塑性改变,HBO+NGF治疗更有利于神经轴突的早期、持续性生长。