乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，我国乳腺癌发病率占全身各种恶性肿瘤的7％~10%，并呈逐年上升趋势，部分大城市报告乳腺癌已占女性恶性肿瘤之首。乳腺癌是全球女性疾病发病率和死亡率的主要原因。据国家癌症中心和卫生部疾病预防控制局2012年公布的2009年乳腺癌发病数据显示：全国肿瘤登记地区乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤的第1位，女性乳腺癌发病率（粗率）全国合计为42.55/10万，城市为51.91/10万，农村为23.12/10万。乳腺癌的治疗进入了综合治疗时代，形成了乳腺癌局部治疗与全身治疗并重的治疗模式。放疗主要是清除残留的乳腺癌细胞，从而达到较好的控制肿瘤生长和提高病人的存活率,但是细胞对辐射的抗辐射性提高了肿瘤的复发率，又妨碍了放疗的抗肿瘤效应，也就是说乳腺癌细胞对IR产生了耐受，这样就影响了IR的抗肿瘤效应，肿瘤易复发。乳腺癌细胞对IR的这种抗辐射性，可能是因为乳腺癌干细胞（Breast cancer stem cells，BCSCs)的存在。已有文献证实，乳腺癌干细胞具有抗辐射性。已经有文献研究认为，IR可诱导非乳腺癌干细胞（即正常乳腺上皮细胞）转换为乳腺癌干细胞（以下讲述将乳腺癌干细胞成为BCSCs）。而这种细胞的转换可能与干细胞基因（c-myc、SOX9，OCT4和KLF4等）的表达有关，有研究发现该基因通过逆转录传导，可重新编码为具有多能性的干细胞，这种多能性的干细胞又可分化为不同类型的细胞。这些基因编码的转录因子在肿瘤干细胞生长和自我更新中起到重要的作用。转录因子Slug和SOX9在正常和恶性细胞中可共同检测乳腺干细胞状态。此外，癌症重组转录因子的过表达与进行性肿瘤和不良预后相关。有研究发现IR通过干细胞基因的再表达，引导分化型癌细胞转变为BCSCs。研究表明：乙醛脱氢酶（Aldehyde dehydrogenase，ALDH）可作为癌干细胞的标记物。在文献中，人和鼠乳腺癌细胞中发现 ALDH1表达增高，认为这些细胞可能是乳腺癌干细胞；这也是本实验的研究基础。双硫仑（Disulfiram，DSF）是美国FDA批准用于治疗酗酒的一种药物，同时也是一种不可逆的ALDH亚型的抑制剂。许多学者研究发现，在细胞内DSF可转换为二乙基二硫代氨基甲酸酯（diethyldithiocarbamate,deDTC）,两分子的deDTC可以和一分子的铜（copper，Cu2+）相结合形成Cu[deDTC]2复合物DSF/Cu；如多学者对DSF/Cu研究发现，它是一种有效的蛋白体酶抑制剂，可以抑制NF-κB信号通路。NF-κB在细胞因子诱导的基因表达中起关键性的调控作用，它调控的基因编码急性期反应蛋白、细胞因子、细胞粘附分子、免疫调节分子、病毒瘤基因、生长因子、转录和生长调控因子等。通过调控多种基因的表达，NF-κB参与免疫反应、炎症反应、细胞凋亡、肿瘤发生等多种生物进程。NF-κB是调节许多基因活性的关键转录因子，这些基因包含细胞凋亡，炎症反应和抗辐射性等。NF-κB还可以调控干细胞基因，例如ERBB2，SOX9，MYC和WNT等的表达。本研究是想通过局部治疗和全身治疗相结合的方法来开发一种新疗法，即通过放疗和DSF相结合作为一种新的治疗方法来治疗乳腺癌。　　目的：本研究提出以下假设：DSF/Cu是否在体内外的试验中下调NF-κB信号传导通路，是否可以提高病人对化疗的敏感性，来消除放疗诱导由非乳腺癌干细胞转变为乳腺癌干细胞，从而达到治疗的效果。　　方法：⑴人乳腺癌细胞系MDA-MB-231，MDA-MB-231-luc-D3H1，SUM149，UACC-812细胞和鼠乳腺癌细胞系4T1细胞用含有10%胎牛血清和2mmol/L的L-glutamine的RPMI1640培养基培养。这种细胞培养基被称为完全培养基。正常人乳腺上皮细胞是用MammaryLife Medium Complete Kit培养。所有的细胞都是放在含有5%CO2的37℃的细胞培养箱中培养。⑵6周龄的NOD/SCID的雌鼠来自Taconic,6周龄的BALB/c的雌鼠来自美国麻省综合医院COX7动物部门。所有的动物实验都经由Insititutional Animal Care和Use Committee的批准。⑶利用Real time PCR检测HER2、SOX9、MYC和WNT3 mRNA的表达水平；⑷利用Western blot检测HER2、SOX9、MYC和WNT3蛋白的表达水平；⑸利用荧光素酶报告试验检测NF-κB的活性；⑹利用微球体形成实验检测乳腺癌干细胞；⑺利用ALDEFLUOR Assay检测ALDHbright细胞的百分比。⑻用SPSS20.0统计软件对实验结果进行统计学处理。所有实验数据结果用±s表示，以α=0.05为检验水准。　　结果：⑴ALDEFLUOR Assay的结果：人乳腺癌细胞系MDA-MB-231，SUM149和UACC-812细胞在接受分级辐射法（3.75 Gy×5day）处理后，ALDHbright细胞的百分比分别增加了2.4倍，1.4倍和4.6倍。而且发现ALDHbright细胞的百分比增加是依赖IR剂量的增加而增加的。IR组与对照组相比，ALDHbright细胞百分比的增加是由ALDHbright细胞绝对数的增加伴随着50.5%总细胞的减少引起的，这表明IR诱导了新的乳腺癌干细胞。⑵微球体形成实验的结果：IR+DMSO和IR+Cu组的微球体数目与对照组相比明显增多，差异有统计学意义（p<0.001）；⑶动物致瘤性试验的结果：IR组的肿瘤大小与对照组相比明显增大，且差异有统计学意义（P=0.02，p<0.05）；⑷经流式细胞仪分选出的ALDHneg细胞，该细胞经过IR和不同药物处理后，采用微球体形成实验的结果：IR组的微球体数目与对照组和IR+DSF组相比明显增高，差异有统计学意义（p<0.001）。⑸ALDEFLUOR Assay的结果：IR+DSF组与对照组、IR、IR+DMSO和IR+Cu相比，ALDHbright细胞数明显减少，差异有统计学意义（p<0.001）；IR+DSF/Cu与对照组、IR、IR+DMSO、IR+DSF和IR+Cu相比，ALDHbright细胞数明显减少，差异有统计学意义（p<0.001）；⑹微球体形成实验的结果：IR+DSF/Cu组的微球体数目与对照组、IR+DMSO、IR+DSF和IR+Cu组相比明显减少，差异有统计学意义（p<0.001）；IR+DSF组的微球体数目与对照组、DSF/Cu、IR+DMSO、IR+Cu和IR+DMSO组相比明显减少，差异有统计学意义（p<0.001）；DSF/Cu组的微球体数目与对照组、IR+DMSO、IR+DSF和IR+Cu组相比明显减少，差异有统计学意义（p<0.001）；⑺动物致瘤性试验的结果：IR+DSF/Cu组的肿瘤大小与对照组相比明显缩小，且差异有统计学意义（p<0.001）；⑻经流式细胞仪分选出的ALDHneg细胞，该细胞经过IR和不同药物处理后，采用微球体形成实验的结果：IR+DSF/Cu组的微球体个数与对照组、IR和IR+DSF组相比显著减少，差异有统计学意义（p<0.001）。⑼细胞增殖和MTT实验结果：而细胞增值和细胞凋亡的实验结果发现，DSF/Cu对正常乳腺上皮细胞（可认为是正常乳腺细胞）的细胞生长抑制率约为10%，而对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的细胞生长抑制率约为50%，两种细胞的生长抑制率相比，差异有统计学意义（p<0.001）。⑽Western Blotting的结果：IR+DSF/Cu组与DSF/Cu组相比，cleaved PARP表达增加、p-p38表达增加，p-AKT表达降低；IR+DSF/Cu组与IR+DMSO组相比，cleaved PARP表达增加、p-p38表达增加，p-AKT表达降低。⑾荧光素酶活性实验的结果：人乳腺癌细胞中IR+DSF/Cu和IR+NF-κBi组的NF-κB相对活性与 IR组相比明显降低，差异有统计学意义（p<0.001）；而且IR+DSF/Cu组的NF-κB相对活性和IR+NF-κBi组的NF-κB相对活性相似。⑿Real-time PCR的结果：IR组的ERBB2，SOX9和MYC基因表达与对照组相比，明显增加，差异有统计学意义（p<0.001）；IR+DSF/Cu组的ERBB2，SOX9和MYC基因表达与IR、IR+DMSO、IR+ROSi组相比明显降低，差异有统计学意义（p<0.001）；IR+NF-κBi和IR+p65 siRNA组和IR组相比，ERBB2，SOX9和MYC基因的mRNA表达水平明显降低；差异有统计学意义（p<0.001）；但是IR+ROSi组与IR组相比，ERBB2，SOX9和MYC基因的mRNA表达水平没有变化；同时还发现 IR+DSF/Cu+ROSi、IR+NF-κBi+ROSi和IR+p65 siRNA+ROSi组与IR组相比，ERBB2，SOX9和MYC基因的mRNA表达水平明显降低；差异有统计学意义（p<0.001）；⒀Western Blotting的结果：IR组的HER2，SOX9和c-Myc蛋白的表达与对照组相比明显增加；IR+DSF/Cu组的HER2，SOX9和c-Myc蛋白的表达与IR、IR+DMSO、IR+ROSi组相比明显降低；IR+NF-κBi和IR+p65 siRNA组和IR组相比，ERBB2，SOX9和MYC蛋白的表达明显降低；但是IR+ROSi组与IR组相比，ERBB2，SOX9和MYC基因蛋白的表达没有变化；同时还发现IR+DSF/Cu+ROSi、IR+NF-κBi+ROSi和IR+p65 siRNA+ROSi组与IR组相比，ERBB2，SOX9和MYC基因蛋白的表达明显降低。⒁Real-time PCR结果显示，IR组的ERBB2，SOX9和MYC基因表达与对照组相比明显增加，差异有统计学意义（p<0.001）；IR+DSF/Cu组的ERBB2，SOX9和MYC基因表达与IR、IR+DMSO、IR+ROSi组相比明显降低，差异有统计学意义（p<0.001）。⒂Western Blotting的结果显示，IR组的SOX9和c-Myc蛋白的表达与对照组相比明显增加；IR+DSF/Cu组的SOX9和c-Myc蛋白的表达与 IR、IR+DMSO、IR+ROSi组相比明显降低。⒃Real-time PCR结果显示：在小鼠动物模型中收集的肿瘤组织，Real-time PCR结果显示，在第15天时，IR组的ERBB2，SOX9，MYC和WNT3基因的表达与对照组相比明显增加，差异有统计学意义（p<0.001）；而 IR+DSF组的ERBB2，SOX9，MYC和WNT3基因的表达与IR相比降低了4.13—6.25倍，差异有统计学意义（p<0.001）；DSF组的ERBB2，SOX9，MYC和WNT3基因的表达与对照相比降低了1.88—6.24倍，差异有统计学意义（p<0.001）；。在第29天时，IR组的ERBB2，SOX9，MYC和WNT3基因的表达与对照组相比明显增加，差异有统计学意义（p<0.001）；IR+DSF组的ERBB2，SOX9，MYC和WNT3基因的表达与IR相比降低了1.92—5.25倍，差异有统计学意义（p<0.001）；DSF组的ERBB2，SOX9，MYC和WNT3基因的表达与对照相比降低了0—2.73倍，差异有统计学意义（p<0.001）。⒄IHC的结果：，IR组的Neu，SOX9和c-myc的表达与对照组相比明显增加，差异有统计学意义（p<0.001）；IR+DSF组的Neu，SOX9、c-myc和WNT3的表达与IR相比明显降低，差异有统计学意义（p<0.001）。⒅微球体形成实验结果表明：在第15天，IR组的微球体数目与对照组相比明显增多，大约增加了61.0%，差异有统计学意义（p<0.001）；IR+DSF/Cu组的微球体数目与 IR相比降低了87.2%，差异有统计学意义（p<0.001）；IR+DSF/Cu组的微球体数目与对照组和DSF组比明显减少，差异有统计学意义（p<0.001）；DSF组的微球体数目与对照组相比明显减少，大约减少了60.2%，差异有统计学意义（p<0.001）；DSF组的微球体数目与IR+DSF组相比明显减少差异有统计学意义（p<0.001）。而在第29天，IR组的微球体数目与对照组相比明显增多，大约增加了84.2%，差异有统计学意义（p<0.001）； IR+DSF/Cu组的微球体数目与IR相比降低了87.2%，差异有统计学意义（p<0.001）；IR+DSF/Cu组的微球体数目与对照组和DSF组比明显减少，差异有统计学意义（p<0.001）；DSF组的微球体数目与对照组相比明显减少，大约减少了64.8%，差异有统计学意义（p<0.001）；DSF组的微球体数目与IR+DSF组相比明显减少差异有统计学意义（p<0.001）。⒆同源性小鼠动物模型的结果：IR组的肿瘤体积与对照组相比，减少了20.1%，差异有统计学（p=0.01，p<0.001）；IR+DSF组的肿瘤体积与IR组相比，约减少了74.2%，差异有统计学意义（p<0.0001）；IR+DSF组的肿瘤体积与DSF组相比，约减少了71.1%，差异有统计学意义（p<0.0001）；IR+DSF组的肿瘤体积与对照组组相比，约减少了79.4%，差异有统计学意义（p<0.001）。⒇对小鼠肿瘤模型的自发性肺转移结节进行分析发现（见图17），IR+DSF组的自发肺转移结节的大小与对照组相比，明显缩小了约89.6%，差异有统计学意义（p<0.001）；DSF组的自发肺转移结节的大小与对照组相比，明显缩小了约20.4%，差异有统计学意义（p<0.001）；与之相反，IR组的自发肺转移结节的大小与对照组相比，明显增大了约51.7%，差异有统计学意义（p<0.001）。　　结论：①IR可使人和鼠乳腺癌细胞系中非BCSCs转化为iBCSCs，使ALDHbright细胞即BCSCs增多；②DSF/Cu可有效阻止非BCSCs转化为iBCSCs；③IR+DSF/Cu可有效消除iBCSCs。