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前言目前恶性肿瘤仍是威胁人类生存的天敌,到2010年,癌症死亡率将超过心脏病,成为全球头号杀手。而肺癌已成为全球发生率最高的恶性肿瘤之一,在北美,肺癌的死亡率居各大肿瘤之首,甚至超过乳腺癌、结肠癌和前列腺癌死亡率的总和。在我国,肺癌的发病率死亡率也迅速上升。在癌症相关的死亡病例中90%是由于肿瘤的侵袭和转移引起的,而肺腺癌晚期时常发生胸腔转移形成胸水。在长期的临床细胞病理诊断当中经过大量的细胞形态学观察我们发现在肺腺癌的一些细胞学标本中癌细胞的胞浆内有一些围绕胞核成葱皮状改变的纤维样结构,尤以恶性胸水中的腺癌细胞为甚。从肺腺癌细胞形态学上的观察引发了我们的一个假设：肺癌胸水中的中晚期肺腺癌细胞是不是同某些发生了纤维化的器官组织一样发生了纤维化、胶原化而分泌胶原蛋白?为验证这一假设,我们利用不同的实验方法对胶原蛋白(Collagen protein) I、Ⅱ、Ⅲ型进行检测。材料与方法1、材料(1)临床资料2007年7月至2009年9月中国医科大学附属第一医院病理科液基薄层细胞学检查(Thin-layer cytology test, TCT)涂片数千例筛选出做过细胞包埋蜡块124例。所有患者术前未经任何治疗。这些病例结合临床病史、影像学诊断及细胞病理证实为肺腺癌的共112例,其中胸水72例,痰标本20例,支气管肺泡灌洗液(BALF)标本20例；另有对照12例为良性胸腔积液。(2)细胞沉渣标本经诊断为肺腺癌的胸水、痰、肺泡灌洗液脱落细胞离心取沉渣,将沉渣转移至EP管,放-70℃冰箱冻存；来自于胸水增生上皮沉渣的收集同上。(3)主要试剂羊抗人COL1A1 COL3A1多克隆抗体、鼠抗人COL2A1单克隆抗体(Santa Cruze,美国),兔抗山羊、羊抗鼠二抗(北京中杉金桥),鼠抗人CK19、TTF-1、Vimentin单克隆抗体(Bio Genex,美国),S-P组化试剂盒,masson氏改良三色染料(厦门迈威生物科技有限公司)2、方法(1) masson特殊染色石蜡细胞学切片常规烤片,脱蜡,水化；A试剂(苏木素染色液)染色5分钟,盐酸酒精分色,水洗返蓝；B试剂(masson氏改良三色染料)常温过夜,水洗至无染料脱落；C试剂(0.2%冰醋酸溶液)洗30秒；梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片；显微镜下观察。(2)免疫细胞化学技术石蜡包埋细胞学标本4μm厚切片常规烤片、脱蜡、水化,采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法(Streptavidin-peroxidase,S-P)按说明书行免疫组化染色。COLlA1、COL2A1、COL3A1一抗稀释浓度均为1：50,二抗浓度1：500, CK19、TTF-1、Vimentin抗体均为即用型抗体。以PBS代替一抗做阴性对照。(3) Western blot技术总蛋白从收集的细胞沉渣标本中提取,以牛血清蛋白作为标准进行蛋白定量,计算各样品蛋白浓度,取等量蛋白,进行SDS-PAGE和转印,分别孵育一抗(COL1A1、COL2A1、COL3A11：500稀释)4℃过夜,相应二抗(1：5000)37℃孵育2h,ECL发光。以β-actin为内参照。3、统计学分析应用SPSS16.0统计分析软件进行分析,胶原纤维在肺腺癌不同细胞学标本中的表达率采用卡方检验,Collagen protein亚型之间的相关性采用非参数Spearman等级相关分析,P<0.05为有统计学意义。结果1、液基薄层细胞学检查观察到有纤维葱皮样结构存在的肿瘤细胞均为肺腺癌细胞且有间质细胞的特征经过TCT,我们在数千例恶性肿瘤细胞胞浆中观察到一些围绕胞核呈葱皮样改变的纤维样结构,而在良性胸水增生的上皮细胞中始终没发现这种结构。在细胞石蜡包埋切片的HE染色中这种结构更加凸显的出现在肿瘤细胞中,甚至有的肿瘤细胞核已经消失,完全被这种胶原纤维结构取代,进一步做了免疫细胞化学染色TTF-1、CK19和Vimentin,证实了这些肿瘤细胞均为肺腺癌细胞并且具有间质细胞的特征。2、胶原纤维在肺腺癌的不同细胞学标本中的表达情况masson特殊染色显示胶原纤维在胸腔积液肺腺癌细胞中的表达率为59.70%(43／72),在痰及支气管肺泡灌洗液的腺癌细胞中表达率分别为20%(4／20)、30%(6／20),在良性胸腔积液增生上皮中不表达(0／12),在胸水中肺腺癌细胞的阳性率要显著高于在痰和肺泡灌洗液中肺腺癌细胞的阳性率(P<0.05),阳性表达为在肿瘤细胞胞浆或胞膜内成一种亮绿色或蓝色。3、胶原蛋白亚型在肺腺癌细胞中的表达及相关性(1)胶原蛋白免疫细胞化学结果胶原蛋白各亚型间表达关系免疫细胞化学结果显示：COL1A1、COL2A1和COL3A1在肺腺癌细胞中的阳性表达率分别为22.6%(28／124),5.6%(7／124),22.6%(28／124),阳性表达主要定位于胞浆,而在增生的上皮细胞中不表达,统计学分析结果显示COL1Al、COL3A1的表达率要显著高于COL2A1的表达率(P=0.024),并且我们发现COL1A1与COL3A1的表达成正相关性(r=0.908,P=0.045)。(2) Western-blot结果Western-blot法检测胶原蛋白亚型在肺腺癌细胞中的表达参照DNA分子量标准,肺腺癌细胞中可见在130KD,190KD,110KD附近有特异性条带,对应位置分别为COL1A1,COL2A1,COL3A1,而在良性胸水增生上皮中表达缺失。结论1、肺腺癌细胞能够分泌胶原蛋白,可能与肺癌的晚期行为有关。2、肺腺癌细胞分泌的胶原蛋白以Ⅰ、Ⅲ型为主。