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植物硫素是存在于植物体内的磺化肽类物质,对促进植物增殖和分化具有重要作用。微波技术和聚乙二醇化修饰技术均是近年来发展起来新技术,在众多领域都得到了广泛的应用。本研究采用微波辐射法辅助固相合成肽类激素-植物硫素,以其为主体进行PEG化修饰,并初步研究其在植物体内的活性效应。
实验首先对微波技术辅助合成植物硫素的工艺进行研究。在固相合成植物硫素前体五肽过程中,实验选择了不同反应量的氨基酸与2-氯树脂进行偶联。当氨基酸与树脂反应比例为1:2时,计算得到氨基酸与树脂结合率为26.0%,则树脂的氨基酸担载量由0.82mmol·g-1降为0.34mmol·g-1。通过单因素实验对磺化条件进行摸索后确定,在以N,N-二甲基乙酰胺作为磺化溶剂,吡啶含量为1:4,微波反应温度40℃,40s升温的条件下,微波辐射反应10min,并在0℃的冰浴中用90%三氟乙酸切割试剂切割60min。得到植物硫素结合率为51.3%,总产物磺化程度达到70.0%。
实验同时探讨了植物硫素的聚乙二醇化修饰工艺及各合成物质的植物活性度。以树脂-肽为起点,比较了微波磺化和聚乙二醇化反应顺序对实验结果的影响。最终确定在先磺化后聚乙二醇化修饰的反应过程下,采用mPEG-OCH3CHO对其进行偶合。反应条件为20℃,pH为6的条件下反应24h,其中修饰剂和还原剂与树脂-PSK端游离氨基的反应比例分别为15倍和12倍。经反相高效液相色谱-质谱分离分析,证明所得产物为目标物PEG-PSK。采用TNBS法测定PEG修饰率,小担载量树脂偶合效果相对较好,修饰率达到41.0%。在比较植物固相化培养和绿豆种子发芽的活性实验结果后得到合成产物PEG-PSK和植物硫素PSK均具有较高的植物活性,与空白对照样品中的激素KT,2,4-D相比,相对活性分别为17.0%和12.8%。