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二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid,EPA）,一种ω-3系列多不饱和脂肪酸（PuFAs）,是人体必须脂肪酸之一,因其具有抗凝血、降血脂、抗炎、抗癌、预防和治疗心血管疾病和糖尿病等重要生理功能而引起广泛关注。EPA传统来源于深海鱼油提取,因其受资源紧张、海洋污染等限制而难以满足市场需求,通过微生物发酵法生产EPA成为目前的研究热点。但是,目前微生物发酵法产EPA的含量仍较低,尚未实现产业化。因此,选育EPA高产菌株仍是研究重点。本文围绕选育EPA高产菌株展开,首先从高山寒冷地带筛选多株PuFAs生产菌株,同时克隆EPA油脂合成相关的关键酶基因MaDGAT,并在建立高山被孢霉遗传转化方法基础上,进一步构建产EPA的高山被孢霉基因工程菌,取得的主要研究结果如下:（1）筛选获得多株PuFAs生产菌株。从秦岭、大别山等地取土样,筛选获得大量微生物,基于关键酶基因Δ6去饱和酶基因克隆定向初筛多株产PuFAs菌株,利用气相色谱-质谱联用方法检测PuFAs生产菌株的脂肪酸组成成分,其中,7株菌可以合成花生四烯酸（ARA）,ITS序列鉴定这些微生物主要为被孢霉属真菌,未筛选获得可以合成EPA的菌株。（2）克隆获得微生物油脂合成关键酶基因MaDGAT,并在酿酒酵母中进行了功能验证。首先,利用RT-PCR的方法从高山被孢霉菌株中成功克隆获得油脂合成关键酶基因MaDGAT;其次,构建了酵母表达载体pYES2-MaDGAT,并转化甘油三酯（TAG）合成缺陷的酿酒酵母H1246进行功能验证,结果表明,MaDGAT基因在酵母中成功表达,使H1246菌株恢复了TAG合成和积累能力,荧光显微镜观察显示,酵母中重新出现了脂质颗粒,同时,酵母菌体油脂含量提高了35.6%。（3）建立了高山被孢霉遗传转化方法,并构建了产EPA的高山被孢霉基因工程菌。首先,建立了以红色荧光蛋白为筛选标记,农杆菌介导的高山被孢霉遗传转化方法,即农杆菌浓度达到OD600为0.8,与106个/mL的高山被孢霉孢子悬液等体积混合,添加乙酰丁香酮至终浓度为150μg/mL,于24℃,200 rpm共培养48 h,之后涂布含烯草酮72μg/mL的PDA平板,培养4-6天观察红色荧光筛选阳性转化子;在此基础上,构建了含MaDGAT基因和Δ17去饱和酶基因的表达载体pCAMBIA1303-DsRed-MaDGAT-D17,并成功转化高山被孢霉,获得5株产EPA的基因工程菌,其中产量最高的菌株摇瓶发酵结果显示,EPA占总油脂比例为10.5%,产量为0.91 g/L。以上研究结果为进一步构建高产EPA基因工程菌,推进微生物发酵法生产EPA的产业化应用奠定了基础。