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目的运用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建并表达重组EV71、CA16病毒样颗粒（Virus-like particle，VLP），对重组EV71、CA16双价VLP疫苗的免疫原性及免疫保护性进行评价，为发展安全、有效、具有保护作用的手足口病新型疫苗奠定基础。方法（1）通过测序分别获得构建EV71、CA16VLP所必需的疫苗候选株基因P1、3CD片段序列，首先根据昆虫密码子偏爱性选择优势密码子，运用分子生物学技术对EV71、CA16P1和3CD基因进行设计和全基因合成。将合成后的P1、3CD序列构建到穿梭质粒pFastBacDual上，通过位点特异性重组筛选阳性重组菌DH10BacTME.coli，将EV71、CA16的重组杆粒Bacmid转染昆虫细胞Sf9获得重组杆状病毒；通过透射电镜、间接免疫荧光、SDS-PAGE、Western blot对纯化的重组EV71、CA16VLP蛋白抗原进行鉴定。（2）将纯化后的重组目的蛋白，联合使用Al(OH)3佐剂，采用腹腔注射的途径免疫4-6周龄ICR小鼠，于0d、14d对小鼠进行两次免疫，一免10d和二免10d后采集小鼠尾静脉血，二免14d后取小鼠脾脏。通过间接ELISA法检测血清IgG抗体效价、血清抗体亚型分布及ELISPOT等方法比较重组EV71、CA16单价及双价VLP疫苗免疫原性；通过体外微量中和试验比较重组EV71、CA16单价及双价VLP疫苗对现有EV71、CA16流行株的保护作用；将EV71、CA16单价及双价VLP疫苗免疫ICR乳母鼠，用EV71、CA16强毒株攻击其新生5日龄乳鼠，观察乳鼠体重变化及存活率，综合比较重组EV71、CA16单价及双价VLP疫苗的免疫保护效果。结果（1）经SDS-PAGE、Western blot以及间接免疫荧光试验结果均证明了EV71、CA16VLP的表达，透射电镜观察可见直径大小约为23～30nm的EV71、CA16VLP，与完整的病毒颗粒结构一致，通过蔗糖密度梯度离心纯化，获得了纯度在90%以上的EV71、CA16VLP抗原；（2）动物实验比较重组EV71、CA16VLP单价、双价疫苗的免疫原性。间接ELISA法显示重组EV71、CA16单价、双价VLP疫苗组与PBS对照组抗体水平差异显著（p<0.05），且双价组显著高于单价组（p<0.05）。中和抗体效价测定显示双价组中和抗体效价高于单价组（p<0.05）。小鼠脾淋巴细胞中IFN-γ和IL-4分泌细胞水平检测显示重组EV71、CA16VLP疫苗各组均可以检测到一定水平的IFN-γ和相对较低水平的IL-4，且双价疫苗组高于单价组。应用EV71-BJ、CA16-TS强毒株分别攻毒，证实重组EV71、CA16单价、双价VLP疫苗均能有效保护5日龄ICR乳鼠抵抗致死剂量病毒的攻击，且双价VLP疫苗保护效果优于单价VLP疫苗。结论通过昆虫杆状病毒表达系统成功构建、表达和纯化EV71、CA16VLP，纯度可达90%以上。研制的重组V71、CA16双价VLP疫苗具有良好的免疫原性，能够刺激机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答。昆虫杆状系统表达的重组EV71、CA16双价VLP疫苗具有较好免疫原性及免疫保护效果，是值得深入研究的手足口病候选疫苗。