论文部分内容阅读
中风是全球死亡/长期致残的最常见原因之一，目前的流行病学数据表明，这种疾病的负担将在未来几十年继续增加，特别是在发展中国家。一旦发生脑缺血，它就会迅速触发与引起不可逆神经元损伤的“缺血性级联”相关的病理途径。这种病理生物学的主要驱动因素是由于实质微环境中的极端变化引起的局部能量可用性危机，例如氧气/葡萄糖浓度的变化和细胞能量储存的耗尽。同时释放神经递质、炎性细胞因子、趋化因子和活性氧物质可加速局部缺血性损伤。虽然中风预防和治疗方面最近取得了进展，卒中发生率和死亡率显著降低，但急性缺血性卒中患者的治疗选择仍然匮乏。将组织型纤溶酶原激活剂(tPA)快速给予适当鉴定的患者群体仍然是脑缺血的主要治疗选择。
在脑缺血再灌注(I / R)损伤中，炎症是导致神经细胞死亡和神经血管损伤以及影响神经发生和脑修复进程的重要病理过程。中风后炎症过程涉及多个细胞。不仅仅是小胶质细胞等炎症细胞，而且包括浸润的血源性巨噬细胞和中性粒细胞参与炎症反应。此外，免疫细胞如自身反应性T淋巴细胞、单核细胞、肥大细胞的浸润使得相对无菌的脑组织对中风的反应更加复杂。激活的炎症细胞分泌许多炎症因子，包括细胞因子、趋化因子、酶、自由基和其他小的分子，随后促进炎症过程和加速BBB分解，神经细胞死亡或影响大脑修复。
Sirtuin3(SIRT3)是NAD+依赖性蛋白质脱乙酰酶Sir2家族的成员。SIRT3主要位于线粒体中，敲除SIRT3导致线粒体蛋白的高度乙酰化。目前的研究已表明，SIRT3在各种疾病中发挥重要作用，例如糖尿病、癌症、神经变性疾病等。但其在脑梗死中的作用目前尚未完全清楚。
而在脑梗死的炎症反应中，作为常驻免疫细胞的小胶质细胞，在损伤发生后几分钟内被激活。被激活的小胶质细胞根据不同的表型和功能以及分泌细胞因子的不同，主要被激活为M1型和M2型小胶质细胞。M1型小胶质细胞为促炎型，主要表现为分泌一系列促炎细胞因子，包括：IL-1b、IL-6、TNF-a、CCL2、CXCL10、ROS、NO、蛋白水解酶基质金属蛋白酶-9和基质金属蛋白酶-3等。M2型小胶质细胞为抗炎型小胶质细胞。抗炎型小胶质细胞能够产生抗炎细胞因子IL-10、TGF-β、IL-4、IL-13和IGF-1，以及表达清除受体，有助于抑制炎症和促进组织修复。研究表明，促进M2表型极化有助于促进损伤后的组织再生。因此，促进小胶质细胞向M2型转变可能是治疗脑梗死起到神经保护作用的关键靶点。
CX3CR1为七次跨膜的Gi蛋白，在中枢神经系统中主要表达在小胶质细胞表面。其主要参与小胶质细胞的迁移功能。而PTX对Gi蛋白起到阻断作用。因此，我们通过过表达或敲低SIRT3，检测SIRT3对CX3CR1表达的影响来探索SIRT3对小胶质细胞迁移功能的影响。
在我们的研究中，我们通过建立MCAO动物模型以及OGD细胞模型，研究SIRT3是否对小胶质细胞的表型极化起到关键作用，对SIRT3是否通过调节LKB1而作用于小胶质细胞进一步研究。并且，我们通过检测CX3CR1的表达水平来探索SIRT3对小胶质细胞迁移功能的作用。
第一部分SIRT3在脑梗死发生后表达显著降低
目的：建立脑梗死小鼠MCAO模型以及建立细胞糖氧剥夺OGD模型，检测SIRT3在脑梗死发生后的表达量。以及确定SIRT3在小胶质细胞内还是神经元内降低。以明确SIRT3在脑梗死发生后发挥的作用。
方法：
1.选取实验动物：选取北京维通利华实验动物公司的SPF级雌性C57BL/6小鼠，周龄10到14周左右，体重大约在20到25g。将小鼠饲养于室内温度在24±2℃、相对湿度在50%-60%的恒温恒湿的环境中，并人工给予明-暗12小时交替循环的照明，保证小鼠拥有足够的饲料和干净的水源。
2.建立tMCAO模型：采用水合氯醛(5%，350mg/kg)腹腔麻醉小鼠。用剪刀清除小鼠颈部毛发后碘酒消毒皮肤。用无菌剪刀在颈正中部剪开1.5CM手术切口，并用尖头镊子分离皮下筋膜以及两侧腺体，可见小鼠气管。采用自制拉钩向外侧拉开颈部皮肤后，暴露胸乳突肌、二腹肌后腹与胸骨舌骨肌形成的三角形区域。用尖镊钝性分离位于该区域的颈动脉鞘，在颈总动脉内侧分离血管(其外侧有白色粗大迷走神经，误伤后小鼠呼吸迅速停止)。分别于颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉挂线结扎。显微剪45度剪开颈外动脉后，插入直径0.22-0.23mm硅胶包被头端的线栓。剪断颈外动脉后翻转线栓，轻柔进线至感到阻力，进线深度参考线栓9-10mm所作蓝色记号笔标记，线栓头端与颈总动脉分叉处距离为10±0.5mm。手术后，小鼠置于自制保温箱内缺血1小时(保温箱内温度32±0.5℃)。缺血完成后拔出线栓完成缺血再灌注，迅速结扎颈外动脉残端并缝合皮肤及筋膜，置于保温箱内至完全苏醒后常规饲养。假手术组除不插入线栓外其余步骤同上。动物完全苏醒后及术后24小时，分别进行神经功能评分并剔除出现蛛网膜下腔出血症状及无神经功能缺失症状小鼠。
3.细胞培养以及建立OGD模型：应用DMEM培养基培养N9细胞以及SK-N-SH细胞。OGD模型：取生长至80-90%的细胞，用OGD缓冲液冲洗3次；去除OGD缓冲液，重新加入OGD缓冲液；将培养板置于厌氧培养盒内，向箱内通入5%CO2、95%N2的混合气体后将培养盒封闭保持37℃培养。
4.应用Westernblot方法检测SIRT3的表达量：包括总蛋白提取、测定蛋白浓度、电泳、转膜、封闭、抗体孵育、扫膜、分析等步骤。
5.应用MTT试验检测OGD对小胶质细胞活性的影响：以每孔5000-10,000个细胞密度，将细胞接种在96孔板上。后加入OGD缓冲液，将不同组的细胞根据不同OGD时间进行处理。处理结束后，向每个孔内加入10ulMTT储备溶液。在37℃培养箱内培养4小时。之后，去除每个孔内的细胞培养基，向每个孔内加入150ulDMSO溶液。37℃培养10分钟，并充分混匀。后应用酶标仪在540nm读取吸光度。
6.应用免疫组化技术检测在脑梗死后，不同的脑区小胶质细胞的数量。
7.统计学方法：采用平均数±标准差(mean±SEM)表示，两组间比较用非配对学生t检验，多组间比较用ANOVA检验，用GraphPadPrism5统计分析软件处理数据。当P值小于0.05时被认为有统计学意义。
结果：
1.SIRT3在MCAO小鼠脑内表达降低：MCAO小鼠脑组织内SIRT3含量相对于Sham手术组明显降低，33.300±2.359MCAOvs.57.730±4.943Sham,P＜0.001。2.SIRT3在OGD处理的小胶质细胞系N9细胞内降低：SIRT3的表达量随着OGD时间的增加而降低,3.153±0.427incontrolvs.1.902±0.008in4hoursOGD，P＜0.05；3.153±0.427incontrolvs.1.095±0.078in8hoursOGD，P＜0.05。
3.N9细胞活性随着OGD时间的增加而下降：OGD处理1小时就可导致N9细胞活性明显降低。并且随着OGD时间的增加，OGD处理4小时，N9细胞活性下降约50%。
4.SIRT3在神经元细胞系SK细胞内经OGD处理后未降低：我们应用OGD处理SK细胞，并检测经过不同时间OGD处理后，SIRT3含量的变化。根据Westernblot结果，我们发现经过不同时间OGD处理后，SIRT3在神经元细胞系SK内并未发生显著变化。
5.在脑梗死区小胶质细胞数量显著增加：通过免疫组化技术，我们发现小胶质细胞在MCAO组的脑梗死区数量相对于对侧脑区以及对照组脑区明显增多。并且，小胶质细胞在梗死区主要表现为被激活的阿米巴样。
小结：脑梗死后可导致SIRT3的表达量降低，主要表现为在小胶质细胞内的降低而非神经元内。表明SIRT3通过在小胶质细胞内的改变而参与脑梗死后的相关病理变化过程。
第二部分SIRT3通过作用于LKB1促进小胶质细胞向M2表型转变
目的：建立细胞糖氧剥夺OGD模型模拟脑梗死条件。应用Lenti-virus在小胶质细胞内过表达以及敲低SIRT3。通过Westernblot技术检测小胶质细胞内SIRT3-LKB1的表达量,来探索在小胶质细胞内SIRT3对LKB1的影响。通过流式细胞学技术检测M2型小胶质细胞的IL-10、TGF-β的表达比例。
方法：
1.细胞培养以及建立OGD模型：应用DMEM培养基培养N9细胞以及SK-N-SH细胞。OGD模型：取生长至80-90%的细胞，用OGD缓冲液冲洗3次；去除OGD缓冲液，重新加入OGD缓冲液；将培养板置于厌氧培养盒内，向箱内通入5%CO2、95%N2的混合气体后将培养盒封闭保持37℃培养。
2.慢病毒构建稳转细胞系：将外源小鼠SIRT3cDNA序列亚克隆到Lenti-CMV-GFP载体中以过表达SIRT3。构建了19个核苷酸的短序列，将SIRT3位点764靶向到OmicsLink小发夹RNA(shRNA)表达克隆中以敲低SIRT3的表达。病毒颗粒侵染细胞：将慢病毒侵染细胞，并应用嘌呤霉素进行筛选。成功转染的细胞表达绿色荧光。
3.应用Westernblot方法检测SIRT3以及LKB1的表达量：包括总蛋白提取、测定蛋白浓度、电泳、转膜、封闭、抗体孵育、扫膜、分析等步骤。
4.应用流式细胞学技术检测小胶质细胞分泌IL-10、TGF-β的表达比例。
5.统计学方法
本论文中所有数据均采用平均数±标准差(mean±SEM)表示，两组间比较用非配对学生t检验，多组间比较用ANOVA检验，用GraphPadPrism5统计分析软件处理数据。当P值小于0.05时被认为有统计学意义。
结果：
我们观察到OGD后VectorN9细胞中pLKB1/LKB1的比例明显增加。我们发现shRNAN9细胞中pLKB1/LKB1的比例在正常条件下与VectorN9细胞相比显著增加。相反，与正常条件下的VectorN9细胞相比，SIRT3N9细胞中pLKB1/LKB1的比例显著下降。与正常情况一致，shRNAN9细胞中OGD条件下pLKB1/LKB1的比例明显高于VectorN9细胞。同时，与OGD条件下的VectorN9细胞相比，SIRT3N9细胞中的比例显著降低。通过流式细胞学技术发现SIRT3引起与M2表型相关的IL-10和TGF-β表达比例增加，说明其促进小胶质细胞向M2表型转变。
小结：OGD导致小胶质细胞内LKB1活性显著增加。在小胶质细胞系N9细胞上过表达SIRT3会导致LKB1的活性降低。与之相反，在N9细胞上敲低SIRT3会引起LKB1的活性显著升高。并且，SIRT3可以促使小胶质细胞向M2表型转化，转化为抑炎型小胶质细胞，从而分泌相关的IL-10以及TGF-β1细胞因子，在缺血性脑卒中起到神经保护作用。
第三部分SIRT3促进小胶质细胞迁移增加
目的：应用Lenti-virus在小胶质细胞内过表达及敲低SIRT3。以及检测CX3CR1的表达量和PTX对小胶质细胞迁移功能的抑制作用，从而探索SIRT3对小胶质细胞迁移功能的影响。
方法：
1.细胞培养：应用DMEM培养基培养N9细胞。GD模型：取生长至80-90%的细胞，用GD缓冲液冲洗3次；去除GD缓冲液，重新加入GD缓冲液。
2.慢病毒构建稳转细胞系：将外源小鼠SIRT3cDNA序列亚克隆到Lenti-CMV-GFP载体中以过表达SIRT3。构建了19个核苷酸的短序列，将SIRT3位点764靶向到OmicsLink小发夹RNA(shRNA)表达克隆中以敲低SIRT3的表达。病毒颗粒侵染细胞：将慢病毒侵染细胞，并应用嘌呤霉素进行筛选。成功转染的细胞表达绿色荧光。
3.细胞迁移实验：通过应用Transwell培养板，并应用DMEM或GD培养基探索小胶质细胞的迁移功能。
4.Westernblot技术检测CX3CR1的表达水平。
5.本论文中所有数据均采用平均数±标准差(mean±SEM)表示，两组间比较用非配对学生t检验，多组间比较用ANOVA检验，用GraphPadPrism5统计分析软件处理数据。当P值小于0.05时被认为有统计学意义。
结果：
SIRT3显著增加了小胶质细胞的迁移能力。SIRT3增加了小胶质细胞CX3CR1的表达量。应用PTX确定SIRT3通过增加CX3CR1的表达量从而促进小胶质细胞的迁移功能。
小结：SIRT3可以显著增加小胶质细胞内CX3CR1的表达量从而促进小胶质细胞的迁移功能。此外，通过应用PTX进一步验证了SIRT3引起小胶质细胞到迁移功能是通过增加CX3CR1的表达量引起。
结论：
1.脑梗死后可导致SIRT3的表达量降低，而主要表现为在小胶质细胞内的降低而非神经元内。这也就表明，SIRT3通过在小胶质细胞内的改变而参与脑梗死后的相关病理变化过程。
2.在小胶质细胞内SIRT3影响LKB1的功能活性，并可能通过该途径引起小胶质细胞向M2表型分化，并且增加IL-10以及TGF-β1细胞因子的分泌。
3.SIRT3增加小胶质细胞内CX3CR1的表达从而促进其迁移作用。4.SIRT3通过增加M2表型的小胶质细胞向脑梗死区域迁移，从而可能起到对脑梗死后损伤的保护作用。
在脑缺血再灌注(I / R)损伤中，炎症是导致神经细胞死亡和神经血管损伤以及影响神经发生和脑修复进程的重要病理过程。中风后炎症过程涉及多个细胞。不仅仅是小胶质细胞等炎症细胞，而且包括浸润的血源性巨噬细胞和中性粒细胞参与炎症反应。此外，免疫细胞如自身反应性T淋巴细胞、单核细胞、肥大细胞的浸润使得相对无菌的脑组织对中风的反应更加复杂。激活的炎症细胞分泌许多炎症因子，包括细胞因子、趋化因子、酶、自由基和其他小的分子，随后促进炎症过程和加速BBB分解，神经细胞死亡或影响大脑修复。
Sirtuin3(SIRT3)是NAD+依赖性蛋白质脱乙酰酶Sir2家族的成员。SIRT3主要位于线粒体中，敲除SIRT3导致线粒体蛋白的高度乙酰化。目前的研究已表明，SIRT3在各种疾病中发挥重要作用，例如糖尿病、癌症、神经变性疾病等。但其在脑梗死中的作用目前尚未完全清楚。
而在脑梗死的炎症反应中，作为常驻免疫细胞的小胶质细胞，在损伤发生后几分钟内被激活。被激活的小胶质细胞根据不同的表型和功能以及分泌细胞因子的不同，主要被激活为M1型和M2型小胶质细胞。M1型小胶质细胞为促炎型，主要表现为分泌一系列促炎细胞因子，包括：IL-1b、IL-6、TNF-a、CCL2、CXCL10、ROS、NO、蛋白水解酶基质金属蛋白酶-9和基质金属蛋白酶-3等。M2型小胶质细胞为抗炎型小胶质细胞。抗炎型小胶质细胞能够产生抗炎细胞因子IL-10、TGF-β、IL-4、IL-13和IGF-1，以及表达清除受体，有助于抑制炎症和促进组织修复。研究表明，促进M2表型极化有助于促进损伤后的组织再生。因此，促进小胶质细胞向M2型转变可能是治疗脑梗死起到神经保护作用的关键靶点。
CX3CR1为七次跨膜的Gi蛋白，在中枢神经系统中主要表达在小胶质细胞表面。其主要参与小胶质细胞的迁移功能。而PTX对Gi蛋白起到阻断作用。因此，我们通过过表达或敲低SIRT3，检测SIRT3对CX3CR1表达的影响来探索SIRT3对小胶质细胞迁移功能的影响。
在我们的研究中，我们通过建立MCAO动物模型以及OGD细胞模型，研究SIRT3是否对小胶质细胞的表型极化起到关键作用，对SIRT3是否通过调节LKB1而作用于小胶质细胞进一步研究。并且，我们通过检测CX3CR1的表达水平来探索SIRT3对小胶质细胞迁移功能的作用。
第一部分SIRT3在脑梗死发生后表达显著降低
目的：建立脑梗死小鼠MCAO模型以及建立细胞糖氧剥夺OGD模型，检测SIRT3在脑梗死发生后的表达量。以及确定SIRT3在小胶质细胞内还是神经元内降低。以明确SIRT3在脑梗死发生后发挥的作用。
方法：
1.选取实验动物：选取北京维通利华实验动物公司的SPF级雌性C57BL/6小鼠，周龄10到14周左右，体重大约在20到25g。将小鼠饲养于室内温度在24±2℃、相对湿度在50%-60%的恒温恒湿的环境中，并人工给予明-暗12小时交替循环的照明，保证小鼠拥有足够的饲料和干净的水源。
2.建立tMCAO模型：采用水合氯醛(5%，350mg/kg)腹腔麻醉小鼠。用剪刀清除小鼠颈部毛发后碘酒消毒皮肤。用无菌剪刀在颈正中部剪开1.5CM手术切口，并用尖头镊子分离皮下筋膜以及两侧腺体，可见小鼠气管。采用自制拉钩向外侧拉开颈部皮肤后，暴露胸乳突肌、二腹肌后腹与胸骨舌骨肌形成的三角形区域。用尖镊钝性分离位于该区域的颈动脉鞘，在颈总动脉内侧分离血管(其外侧有白色粗大迷走神经，误伤后小鼠呼吸迅速停止)。分别于颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉挂线结扎。显微剪45度剪开颈外动脉后，插入直径0.22-0.23mm硅胶包被头端的线栓。剪断颈外动脉后翻转线栓，轻柔进线至感到阻力，进线深度参考线栓9-10mm所作蓝色记号笔标记，线栓头端与颈总动脉分叉处距离为10±0.5mm。手术后，小鼠置于自制保温箱内缺血1小时(保温箱内温度32±0.5℃)。缺血完成后拔出线栓完成缺血再灌注，迅速结扎颈外动脉残端并缝合皮肤及筋膜，置于保温箱内至完全苏醒后常规饲养。假手术组除不插入线栓外其余步骤同上。动物完全苏醒后及术后24小时，分别进行神经功能评分并剔除出现蛛网膜下腔出血症状及无神经功能缺失症状小鼠。
3.细胞培养以及建立OGD模型：应用DMEM培养基培养N9细胞以及SK-N-SH细胞。OGD模型：取生长至80-90%的细胞，用OGD缓冲液冲洗3次；去除OGD缓冲液，重新加入OGD缓冲液；将培养板置于厌氧培养盒内，向箱内通入5%CO2、95%N2的混合气体后将培养盒封闭保持37℃培养。
4.应用Westernblot方法检测SIRT3的表达量：包括总蛋白提取、测定蛋白浓度、电泳、转膜、封闭、抗体孵育、扫膜、分析等步骤。
5.应用MTT试验检测OGD对小胶质细胞活性的影响：以每孔5000-10,000个细胞密度，将细胞接种在96孔板上。后加入OGD缓冲液，将不同组的细胞根据不同OGD时间进行处理。处理结束后，向每个孔内加入10ulMTT储备溶液。在37℃培养箱内培养4小时。之后，去除每个孔内的细胞培养基，向每个孔内加入150ulDMSO溶液。37℃培养10分钟，并充分混匀。后应用酶标仪在540nm读取吸光度。
6.应用免疫组化技术检测在脑梗死后，不同的脑区小胶质细胞的数量。
7.统计学方法：采用平均数±标准差(mean±SEM)表示，两组间比较用非配对学生t检验，多组间比较用ANOVA检验，用GraphPadPrism5统计分析软件处理数据。当P值小于0.05时被认为有统计学意义。
结果：
1.SIRT3在MCAO小鼠脑内表达降低：MCAO小鼠脑组织内SIRT3含量相对于Sham手术组明显降低，33.300±2.359MCAOvs.57.730±4.943Sham,P＜0.001。2.SIRT3在OGD处理的小胶质细胞系N9细胞内降低：SIRT3的表达量随着OGD时间的增加而降低,3.153±0.427incontrolvs.1.902±0.008in4hoursOGD，P＜0.05；3.153±0.427incontrolvs.1.095±0.078in8hoursOGD，P＜0.05。
3.N9细胞活性随着OGD时间的增加而下降：OGD处理1小时就可导致N9细胞活性明显降低。并且随着OGD时间的增加，OGD处理4小时，N9细胞活性下降约50%。
4.SIRT3在神经元细胞系SK细胞内经OGD处理后未降低：我们应用OGD处理SK细胞，并检测经过不同时间OGD处理后，SIRT3含量的变化。根据Westernblot结果，我们发现经过不同时间OGD处理后，SIRT3在神经元细胞系SK内并未发生显著变化。
5.在脑梗死区小胶质细胞数量显著增加：通过免疫组化技术，我们发现小胶质细胞在MCAO组的脑梗死区数量相对于对侧脑区以及对照组脑区明显增多。并且，小胶质细胞在梗死区主要表现为被激活的阿米巴样。
小结：脑梗死后可导致SIRT3的表达量降低，主要表现为在小胶质细胞内的降低而非神经元内。表明SIRT3通过在小胶质细胞内的改变而参与脑梗死后的相关病理变化过程。
第二部分SIRT3通过作用于LKB1促进小胶质细胞向M2表型转变
目的：建立细胞糖氧剥夺OGD模型模拟脑梗死条件。应用Lenti-virus在小胶质细胞内过表达以及敲低SIRT3。通过Westernblot技术检测小胶质细胞内SIRT3-LKB1的表达量,来探索在小胶质细胞内SIRT3对LKB1的影响。通过流式细胞学技术检测M2型小胶质细胞的IL-10、TGF-β的表达比例。
方法：
1.细胞培养以及建立OGD模型：应用DMEM培养基培养N9细胞以及SK-N-SH细胞。OGD模型：取生长至80-90%的细胞，用OGD缓冲液冲洗3次；去除OGD缓冲液，重新加入OGD缓冲液；将培养板置于厌氧培养盒内，向箱内通入5%CO2、95%N2的混合气体后将培养盒封闭保持37℃培养。
2.慢病毒构建稳转细胞系：将外源小鼠SIRT3cDNA序列亚克隆到Lenti-CMV-GFP载体中以过表达SIRT3。构建了19个核苷酸的短序列，将SIRT3位点764靶向到OmicsLink小发夹RNA(shRNA)表达克隆中以敲低SIRT3的表达。病毒颗粒侵染细胞：将慢病毒侵染细胞，并应用嘌呤霉素进行筛选。成功转染的细胞表达绿色荧光。
3.应用Westernblot方法检测SIRT3以及LKB1的表达量：包括总蛋白提取、测定蛋白浓度、电泳、转膜、封闭、抗体孵育、扫膜、分析等步骤。
4.应用流式细胞学技术检测小胶质细胞分泌IL-10、TGF-β的表达比例。
5.统计学方法
本论文中所有数据均采用平均数±标准差(mean±SEM)表示，两组间比较用非配对学生t检验，多组间比较用ANOVA检验，用GraphPadPrism5统计分析软件处理数据。当P值小于0.05时被认为有统计学意义。
结果：
我们观察到OGD后VectorN9细胞中pLKB1/LKB1的比例明显增加。我们发现shRNAN9细胞中pLKB1/LKB1的比例在正常条件下与VectorN9细胞相比显著增加。相反，与正常条件下的VectorN9细胞相比，SIRT3N9细胞中pLKB1/LKB1的比例显著下降。与正常情况一致，shRNAN9细胞中OGD条件下pLKB1/LKB1的比例明显高于VectorN9细胞。同时，与OGD条件下的VectorN9细胞相比，SIRT3N9细胞中的比例显著降低。通过流式细胞学技术发现SIRT3引起与M2表型相关的IL-10和TGF-β表达比例增加，说明其促进小胶质细胞向M2表型转变。
小结：OGD导致小胶质细胞内LKB1活性显著增加。在小胶质细胞系N9细胞上过表达SIRT3会导致LKB1的活性降低。与之相反，在N9细胞上敲低SIRT3会引起LKB1的活性显著升高。并且，SIRT3可以促使小胶质细胞向M2表型转化，转化为抑炎型小胶质细胞，从而分泌相关的IL-10以及TGF-β1细胞因子，在缺血性脑卒中起到神经保护作用。
第三部分SIRT3促进小胶质细胞迁移增加
目的：应用Lenti-virus在小胶质细胞内过表达及敲低SIRT3。以及检测CX3CR1的表达量和PTX对小胶质细胞迁移功能的抑制作用，从而探索SIRT3对小胶质细胞迁移功能的影响。
方法：
1.细胞培养：应用DMEM培养基培养N9细胞。GD模型：取生长至80-90%的细胞，用GD缓冲液冲洗3次；去除GD缓冲液，重新加入GD缓冲液。
2.慢病毒构建稳转细胞系：将外源小鼠SIRT3cDNA序列亚克隆到Lenti-CMV-GFP载体中以过表达SIRT3。构建了19个核苷酸的短序列，将SIRT3位点764靶向到OmicsLink小发夹RNA(shRNA)表达克隆中以敲低SIRT3的表达。病毒颗粒侵染细胞：将慢病毒侵染细胞，并应用嘌呤霉素进行筛选。成功转染的细胞表达绿色荧光。
3.细胞迁移实验：通过应用Transwell培养板，并应用DMEM或GD培养基探索小胶质细胞的迁移功能。
4.Westernblot技术检测CX3CR1的表达水平。
5.本论文中所有数据均采用平均数±标准差(mean±SEM)表示，两组间比较用非配对学生t检验，多组间比较用ANOVA检验，用GraphPadPrism5统计分析软件处理数据。当P值小于0.05时被认为有统计学意义。
结果：
SIRT3显著增加了小胶质细胞的迁移能力。SIRT3增加了小胶质细胞CX3CR1的表达量。应用PTX确定SIRT3通过增加CX3CR1的表达量从而促进小胶质细胞的迁移功能。
小结：SIRT3可以显著增加小胶质细胞内CX3CR1的表达量从而促进小胶质细胞的迁移功能。此外，通过应用PTX进一步验证了SIRT3引起小胶质细胞到迁移功能是通过增加CX3CR1的表达量引起。
结论：
1.脑梗死后可导致SIRT3的表达量降低，而主要表现为在小胶质细胞内的降低而非神经元内。这也就表明，SIRT3通过在小胶质细胞内的改变而参与脑梗死后的相关病理变化过程。
2.在小胶质细胞内SIRT3影响LKB1的功能活性，并可能通过该途径引起小胶质细胞向M2表型分化，并且增加IL-10以及TGF-β1细胞因子的分泌。
3.SIRT3增加小胶质细胞内CX3CR1的表达从而促进其迁移作用。4.SIRT3通过增加M2表型的小胶质细胞向脑梗死区域迁移，从而可能起到对脑梗死后损伤的保护作用。