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研究背景近年来,UVA的生物学效应日益受到重视。研究表明,一方面紫外线照射可导致人体细胞产生过量活性氧簇（ROS）从而引起细胞的氧化损伤。通常人体细胞在生理状态下产生的ROS水平很低,并可被体内酶性抗氧化物如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等和非酶性抗氧化物如谷胱甘肽、维生素C、维生素E、辅酶Q等清除。另一方面,急性或长期的UV暴露还可下调抗氧化系统。因此,过多产生的ROS与抗氧化防御系统间的失衡,最终可导致细胞的氧化损伤。本研究通过测定细胞经UV照射后而引起氧化损伤的生物标志（如SOD、CAT、GSH-Px、ROS和8-isoprostane）的测定,既可以反映机体的抗氧化能力,也可间接反映机体受自由基损伤的程度。预防紫外线重要措施之一就是使用防晒化妆品。目前,对于防晒化妆品防晒效果的评价,国际上一般采用人体法和仪器法（紫外光谱法和SPF仪法）,尚无可靠的体外生物学评价方法。因此我们尝试建立一种有别于传统防晒化妆品评价方法的体外生物学评价体系。本研究以长波紫外线辐射所引起的细胞氧化损伤为理论基础,以体外培养的HaCaT细胞为生物材料,通过对紫外线照射细胞后引起氧化损伤的多种生物标志（如ROS、8-isoprostane、SOD、GSH-Px和CAT）的检测来定性评价防晒化妆品的紫外线防护作用。研究目的以体外培养的永生化人皮肤角质形成细胞（HaCaT）为生物材料,通过对UVA所致氧化损伤的五种生物标志（ROS、8-isoprostane、SOD、GSH-Px和CAT）的检测,建立一种适合评估防晒化妆品紫外线防护作用的体外细胞试验评价方法。研究内容与方法1.细胞培养:以含10%胎牛血清的DMEM培养基培养永生化人皮肤角质形成细胞,定量接种于24孔板或60mm培养皿中,置37℃、5%CO2培养箱中培养。2.采用MTT法测定不同剂量UVA照射对HaCaT细胞增殖活力的影响,确定后续实验UVA的照射剂量;在确定的UVA照射剂量下测定抗氧化剂和防晒化妆品对UVA照射后HaCaT细胞增殖活力的影响,为后续实验提供防晒化妆品剂量选择的依据;3.UVA照射对细胞氧化损伤作用的研究:荧光探针（CM-H2DCFDA）标记ROS的方法测定UVA照射对细胞ROS生成的影响,ELISA法检测UVA照射对细胞8-isoprostane生成的影响,酶生化法测定UVA照射对细胞内SOD、GSH-Px和CAT酶活力的影响,并选用两种抗氧化剂（VitE和VitC）作为阳性对照,来评价这五项指标作为氧化损伤的生物标志是否稳定且敏感;4.防晒化妆品对UVA照射所致氧化损伤的保护作用研究:分别用上述五项氧化损伤生物标志,对加入防晒化妆品进行干预后各指标的量值变化进行评价,考察这五项生物标志是否适用于评价防晒化妆品的紫外线防护作用,并筛选出最适评价指标。研究结果1.MTT实验结果显示:1.1 8 J/cm2UVA照射对HaCaT细胞增殖活性未产生明显影响,说明在此剂量照射下细胞仍保持良好的增殖活力,适合进行下一步实验。1.2 VitE（25、50、100μmol/L）和VitC（125、250、500μmol/L）预孵育细胞16h后经UVA照射,可明显提高HaCaT细胞增殖活性;确定后续试验防晒化妆品使用剂量如下:样品1为125、250、500μg/ml,样品2为62.5、125、500μg/ml,样品3为31.2、62.5、125μG/ml,样品4为62.5、125、250μg/ml,样品5为62.5、125、250μg/ml,样品6为125、250、500μg/ml,样品7为62.5、125、250μg/ml,样品8为62.5、125、250μg/ml,样品9为125、250、500μg/ml。2. UVA照射对HaCaT细胞氧化损伤作用的研究:经8J/cm2 UVA照射后,HaCaT细胞SOD、CAT、GSH-Px的活性较未经UVA照射的细胞显著下降,而ROS和8-isoprostane的生成量则显著上升,VitE（25、50、100μmol/L）或VitC（125、250、500μmol/L）作为阳性对照干预处理HaCaT细胞后,再用8J/cm2 UVA照射,细胞的SOD、CAT、GSH-Px的酶活性呈剂量依赖性升高,而ROS和8-isoprostane的生成量则呈剂量依赖性降低。3.防晒化妆品对UVA所致细胞氧化损伤的保护作用研究结果如下表所示:注:+表示该化妆品样品在一定剂量内能明显改变UVA（8J/cm2）照射细胞后各生物标志的量值,表明该样品对UVA引起的氧化损伤有保护作用; -表示该化妆品样品在一定剂量内对UVA（8J/cm2）照射细胞后各生物标志的量值未产生明显影响,表明该样品对UVA引起的氧化损伤未呈现保护作用。研究结论1.本研究结果显示紫外线照射所致细胞氧化损伤过程中,ROS、8-isoprostane及SOD三项指标反应较为敏感,可作为生物标志用于定性评价防晒化妆品的紫外线防护作用,CAT和GSH-Px的灵敏程度不如ROS、8-isoprostane及SOD三项指标;2.ROS、8-isoprostane及SOD三项指标综合使用有助于准确评价防晒化妆品的紫外线防护作用;3.本研究中的体外细胞法用于定性评价防晒化妆品的紫外线防护作用是可行的,且具有操作简便、快速、经济、周期短和重复性好等优点;4.8-isoprostane作为一种新型氧化损伤生物标志首次应用于防晒化妆品紫外线防护作用的体外细胞法评价体系,在国内外同类研究中尚未见报道;5.本研究建立了一种可定性评价防晒化妆品紫外线防护作用的体外评价体系,如何进行定量评价还有待于后续研究进一步探讨。