目的放射性脑组织损伤尚无敏感的机能蛋白标记物,为分析放射性脑组织损伤的病理生理进程、损伤的进展、修复及转归,追踪敏感反应蛋白具有重要的意义。本次实验研究工作主要着眼于GFAP在放射性脑损伤后的蛋白表达的改变,结合CD34~+细胞移植条件下的GFAP表达分析,试图探寻GFAP作为新的机能蛋白标记物的可能性,为评价放射性脑损伤提供新的量化分析指标,为今后进一步研究放射性脑损伤的修复及其转归提供重要参考。方法1动物分组及大鼠放射性脑损伤模型的制作:选用成年健康雄性SD大鼠60只,体质量为210 g-230 g,将大鼠随机分为空白对照组、放射性脑损伤组和伤后移植组,其中,放射性脑损伤组分为伤后7、14、28d 3个亚组,每组12只大鼠;在放射性脑损伤后第7天对伤后移植组大鼠进行CD34~+细胞移植手术并且同时在放射性损伤后的14及28天进行观察比较,每组6只大鼠。采用CT进行大脑局部照射,以此来制作大鼠放射性脑损伤模型。2 CD34~+细胞的收集、标记与移植:利用流式分选法收集CD34~+细胞,并利用外源性的BrdU对CD34~+细胞进行标记,在放射性脑损伤后的第7天选用大鼠尾静脉注入被标记的CD34~+细胞,进行CD34~+细胞移植。3各个指标的检测:对照组和放射组各取6只大鼠,通过微循环显微成像系统,检测损伤区脑皮质及对照组脑皮质微血管的通透性,应用Image-proplus5.0专业医学图像分析软件检测血管内外伊文思蓝染色的累积光密度值(integrated optical density,IOD)并将血管外伊文思蓝染色的IOD值与血管内、外伊文思蓝染色的IOD值总和之比作为观察指标,以此对微血管的通透性进行评估;各组随机选取6只大鼠,取损伤区域3 mm脑组织置于4%多聚甲醛溶液中浸泡固定、常规脱水、石蜡包埋,作连续冠状面切片,进行GFAP、BrdU免疫组化染色。在400倍光镜下由两名实验人员采用双盲法(独立检测)进行计数,染成棕黄色的细胞可视为GFAP及BrdU阳性细胞,GFAP免疫组化结果应用Image-proplus 5.0专业医学图像分析软件检测阳性染色的累积光密度值(IOD)。结果1放射性脑损伤后,我们使用微循环显微仪观察损伤区大脑皮质微血管的改变,通过图片可以很明显的观察到,对照组伊文思蓝局限于血管内部,放射性脑损伤组伊文思蓝广泛渗透至脑组织。通过软件分析、计算出伊文思蓝渗出比例,结果显示放射性脑损伤后脑皮质血管伊文思蓝渗出比例明显上升,虽然随着时间的推移放射性脑损伤组伊文思蓝渗出比例逐渐下降,但其依旧明显高于对照组。2采用免疫组化实验方法检测对照组、放射性脑损伤组以及损伤后移植组GFAP的表达,结果显示,相比较对照组,放射性脑损伤后第7天GFAP阳性表达明显增强,而后在14、28天逐渐减弱,但其表达水平仍然高于对照组;在照射后14、28天,移植组GFAP表达量均较同期放射组表达量下降。3我们同样采用免疫组化的方法检测了移植组BrdU的表达,通过显微镜拍摄可以看到照射后14天和28天移植组大鼠脑组织中均有明显黄染的BrdU。结论1本次实验利用CT X线制作出大鼠放射性脑损伤模型,通过实验分析,发现了放射线照射前后前述指标差异的显著性,在前期工作的基础上,进一步佐证了放射性脑损伤造模的成功。2本次实验运用伊文思蓝作为示踪剂,检测放射性脑损伤后皮质血管的通透性,明显观察到放射性脑损伤后,伊文思蓝的渗出增加,从而更直观的证实了放射性脑损伤动物模型制作的成功。3在本次研究中,我们采用免疫组化的实验方法对放射性脑损伤大鼠的大脑皮质区GFAP的表达进行分析,免疫组化结果显示,在照射后GFAP的表达水平随即升高,经照射后大鼠脑内GFAP表达变化趋势与微循环显微仪所观察的血管通透性的变化趋势相一致;而在进行CD34~+细胞移植后,GFAP的阳性表达明显较放射组减弱,通过对GFAP表达趋势的分析,进一步证实了GFAP作为蛋白标记物对放射性脑损伤损伤程度、修复程度进行评价的可行性,这也对放射性脑损伤的诊断及病程进展分析具有量化的意义。4本次实验,鉴于免疫组化的分析结果,移植各亚组均可检测到BrdU标记的CD34~+细胞,证实了CD34~+细胞在被移植脑组织中的持续存活,说明经尾静脉移植的方法是有效的,这也为我们今后进一步的研究提供良好的技术支持。