线粒体是细胞有氧能量代谢的重要器官,线粒体研究对动物高原适应性、低氧胁迫耐受性具有重要意义;越来越多的疾病被发现是线粒体基因组发生突变造成的。因此,线粒体基因组编辑逐渐成为了科学家们的研究热点。随着CRISPR/Cas9技术的迅速发展和完善,鉴于锌指核酸酶(Zinc-Finger Nucleases,ZFNs)、TALE核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nucleases,TALENs)等核酸酶技术在哺乳动物线粒体基因组编辑方面的成功应用,人们开始尝试改造CRISPR/Cas9系统进行线粒体基因组编辑。CRISPR/Cas9系统主要是利用Cas9核酸酶与单链导向RNA(sg RNA)复合物,通过更有效地诱导基因组DNA中特定位点的双链断裂,进而实现高效的基因组编辑。对于线粒体基因组DNA(mt DNA)来说,其双链断裂的修复机制尚不明确,细胞会在清除断裂mt DNA的同时增加其拷贝数至正常水平。另外,RNA进入线粒体的机制亦不明确,利用CRISPR/Cas9系统进行mt DNA编辑时,sg RNA的线粒体靶向递送尚存在困难。本研究针对哺乳动物线粒体编辑,对CRISPR/Cas9系统中的sg RNA和Cas9进行了线粒体靶向递送改造,初步建立了Mito-CRISPR/Cas9线粒体基因组编辑平台,主要结果如下:(1)构建了线粒体靶向递送的4种sg RNA表达载体,分别加入了RP茎环序列,3’UTR序列和终止序列等元件;转染细胞后,提取线粒体RNA进行RT-PCR半定量检测,4组的sg RNA均能有效的进入线粒体,其中g RUP组的效率最高。(2)构建了线粒体靶向递送的3种GFP和Cas9表达载体,分别加入不同的线粒体定位信号;将3种不同的GFP表达载体转染细胞后,通过Western Blot实验检测,3种携带不同线粒体定位信号的GFP均能有效进入线粒体,间接说明了经改造的Cas9可用于线粒体基因组编辑。总之,本研究对CRISPR/Cas9系统的改造,初步建立了Mito-CRISPR/Cas9线粒体基因组编辑平台,为基于mt DNA编辑的基础生物学、医学及动物育种研究工作奠定了基础。