背景与目的：中耳胆脂瘤是耳鼻咽喉科常见的慢性疾病之一。之所以称之为“瘤”,因为它是中耳的囊性结构,外层纤维组织与邻近骨质或组织紧密相连,囊壁内层是鳞状上皮,囊内充满脱落的坏死上皮、角化物质和胆固醇结晶,具有肿瘤样的破坏、侵袭、迁移、分化变异及复发性特点,并可引起严重的颅内并发症而危及生命。近年来国内外学者通过免疫和分子生物学检测手段对胆脂瘤的发病机理进行了研究,从局部化学介质信息分子、信息传导、基因调控物质的表达及分布特点等方面,对其增殖、凋亡及骨质破坏的发生机制作了探索。但其确切的发病机制尚未完全阐明。目前细胞凋亡在恶性肿瘤的发生机制中的作用受到越来越多的重视,认为恶性肿瘤的细胞凋亡受到抑制。但有关胆脂瘤中细胞凋亡情况的研究报道不多,并且结果也不完全一致。机体内存在两类影响细胞凋亡的因子,促凋亡因子如RPR、Smac、H6Ra2、Caspases和凋亡抑制因子如Bcl-2、CrmA、P53、IAPs。由于Caspase家族可自我活化并能相互激活,所以凋亡过程一旦触发,呈级联放大效应,在凋亡的执行阶段起主要作用。因此认为Caspases蛋白酶解级联反应是细胞凋亡的核心机制。而Caspase-9是Caspases系统引起凋亡的最重要的起始因子。IAPs(inhibitor of apoptosis proteins, IAPs)家族是一类新的独立于Bcl-2的内源性的抗凋亡蛋白。Livin是新发现的凋亡抑制蛋白家族成员之一,Livin在大多数正常组织中不表达或弱表达,在多数肿瘤组织中高表达,可有效阻断多种因子诱导的细胞凋亡Livin主要通过和Caspase蛋白结合抑制其级联激活反应而发挥抗凋亡作用。研究发现,Livin可以直接和未加工的或断裂形成的Caspase-9结合并抑制其活性,阻断它们依次激活,同时阻断了Caspase-3对Caspase-9前体的反馈激活,抑制细胞凋亡目前多数研究显示：与正常外耳道皮肤相比,促凋亡因子在中耳胆脂瘤中的表达明显增高,提示胆脂瘤上皮细胞凋亡能力增强。但对抑制凋亡因子在胆脂瘤中的表达报道不一致。近来大量文献报道凋亡抑制因子Livin在恶性肿瘤中(如肺癌、子宫内膜癌、胃癌等)高表达,与促凋亡因子Caspase-9呈负相关系。那么凋亡抑制因子Livin在胆脂瘤中的表达情况如何?至今尚未见报道。我们设想凋亡促进因子Caspase-9和凋亡抑制因子Livin同时参与了胆脂瘤的病理生理过程,那么它们之间的关系如何呢?本研究旨在探讨凋亡相关因子Caspase-9和Livin在中耳胆脂瘤上皮组织中的表达水平及相关性,揭示Caspase-9和Livin因子在中耳胆脂瘤发生发展中的作用,深入认识中耳胆脂瘤发病机制,并为中耳胆脂瘤的临床治疗方法提供新的思路。方法：1、标本来源及处理：所有标本均为手术中所取的新鲜标本,均来自郑州大学第一附属医院,所有患者均为第一次手术。标本均经我院病理科证实,HE染色23份胆脂瘤标本中均含有角化碎屑或者胆固醇结晶；并都含有胆脂瘤上皮,为复层鳞状上皮,不同部位鳞状上皮分层不同；鳞状上皮可见明显的局部乳头状生长,而且在乳头状生长的部位,鳞状上皮分层尤其不规则。所有新鲜标本取出后迅速放入10%中性甲醛溶液充分固定,常规石蜡包埋,4μm厚的连续切片。捞出组织切片,置于60℃恒温烤箱中烤片2小时,烤片后所有切片存于40冰箱以备免疫组化染色用。2、免疫组织化学染色：石蜡切片脱蜡；蒸馏水和PBS液冲洗；抗原热修复后PBS液冲洗；3%H202孵育及PBS液冲洗；室温下山羊血清封闭后滴加一抗、40冰箱过夜；自冰箱取出放至室温,PBS冲洗；滴加二抗、PBS冲洗；滴加辣根酶标记链酶卵白素、PBS冲洗；配制DBA、显色；苏木素复染；脱水、封片。3、图像分析方法：采用Olympus BH-2光学显微镜和(上海山富科学仪器有限公司)Biosens Digatal Imaging System显微图像分析系统对标本切片的免疫组化染色结果进行分析。每张切片于×400光镜下选取不相叠的5个视野,在Olympus BH-2光学显微镜下(×400)观察并计数阳性表达的细胞数目,然后通过数码摄像系统摄所有标本免疫组化染色图像并转存于计算机中用Biosens Digatal Imaging System数字图像处理系统,测量Caspase-9和Livin阳性细胞的平均灰度值,取其均值为该标本测量结果。4、统计学方法：用成组设计两样本均数t检验分别检测Caspase-9和Livin蛋白在中耳胆脂瘤及外耳道正常皮肤中表达量的差异,研究数据用均数±标准差表示。用两独立样本四格表资料X2检验法计算Livin和Caspase-9蛋白的相关性。采用多重线性回归方法分析患者的年龄、听力损失程度、性别、病程、骨质破坏程度是否与Caspase-9蛋白和Livin蛋白在中耳胆脂瘤中表达有关。统计学分析采用SPSS10.0数据处理软件包,p>0.05为差异无统计学意义。结果：1.定位结果：①光学显微镜下Caspase-9主要在细胞浆和核膜中表达,阳性细胞呈棕黄色,Caspase-9在中耳胆脂瘤上皮细胞由基底层向外至角质层细胞中均有不同程度染色,但主要分布在颗粒层和棘层；Caspase-9也在外耳道正常皮肤的颗粒层和棘层中表达。②Livin阳性细胞主要定位在细胞浆,呈棕黄色,细胞核有时也有染色,在胆脂瘤上皮细胞中位于上皮全层；Livin散在表达于外耳道正常皮肤中的基底层和基底上层。2.定量结果：①Caspase-9在中耳胆脂瘤上皮细胞的颗粒层和棘层表达密集,阳性表达细胞数是87.21±9.45,平均灰度值为124.68±67.23；在正常外耳道皮肤中表达稀疏,阳性表达细胞数是35.13±10.17,平均灰度值为68.25±47.17, Caspase-9在胆脂瘤中的表达明显高于正常外耳道皮肤,差异有统计学意义(p<0.05)。②在胆脂瘤和正常外耳道皮肤中Livin的阳性细胞数为38.17±10.21和19.56±4.96；平均灰度值分别是75.66±56.54和56.99±49.07, Livin蛋白在胆脂瘤中的表达明显高于正常外耳道皮肤,差异有统计学意义(p<0.05)3.相关性结果：在相关性研究中,Caspase-9表达和Livin蛋白表达同时表达阳性的有14例；Caspase-9蛋白表达阴性中有1例Livin蛋白表达阳性；有4例同时表达为阴性；Caspase-9蛋白表达阳性中有4例Livin表达为阴性。统计学采用两独立样本四格表资料x2检验,p<0.05,在胆脂瘤的表达中二者有统计学意义。结论：1.与正常外耳道皮肤相比,凋亡促进蛋白Caspase-9在中耳胆脂瘤中高表达,表明胆脂瘤上皮细胞的凋亡能力增加。2.凋亡抑制蛋白livin在中耳胆脂瘤上皮的表达水平显著高于正常外耳道皮肤,说明在胆脂瘤上皮细胞中抑制凋亡的能力也相应增强。3.凋亡促进蛋白Caspase-9和抑制凋亡蛋白livin在中耳胆脂瘤中表达密切相关,同步升高,提示就凋亡过程而言,二者达到了新的平衡。这也是中耳胆脂瘤不同与恶性肿瘤细胞凋亡受抑制而处于无限增殖状态之处。