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全球可耕地面积约30%为酸性土壤。在中国,酸性土壤占全国土地面积的21%,酸性土壤中含有多种植物生长的障碍因子,如：低磷、酸害、铝毒等,其中铝毒害已经成为酸性土壤中农作物产量的一个重要限制因子。分子生物学技术是提高作物抗铝毒能力的根本手段。本研究室的前期研究表明铝胁迫诱导耐受型丹波黑大豆(简称RB)和敏感型黑大豆(简称SB),叶片和根中过氧化氢的含量上升,暗示铝毒害引起RB和SB的氧化胁迫。有研究表明铝胁迫诱导植物细胞ROS的产生,引起膜脂过氧化,其产物多为对细胞有毒的醛类物质。醛脱氢酶(ALDH)基因是一类编码催化醛类脱氢氧化为相应羧酸的基因,对植物具有保护脱毒作用。为鉴定铝诱导基因,实验组前期构建了SB和RB根铝胁迫下的SSH cDNA文库,分析比较发现50μM铝诱导RBALDH基因的表达,而不诱导SB ALDH表达,推测ALDH可能参与了铝胁迫下膜脂过氧化的保护脱毒。本研究克隆RB中ALDH基因,确定其全长序列；同时通过构建RB的ALDH原核表达载体,诱导和分离纯化ALDH蛋白,检测其在体外的催化底物和活性；构建植物表达载体并转化野生型烟草,分析转基因烟草和野生型烟草的抗铝毒能力,进一步验证ALDH的功能。为改良大豆的抗铝毒能力奠定了一定的理论基础。主要研究结果如下：在100,200,300和400μmol-L-1浓度的铝胁迫下,RB根中的MDA、H2O2、PC含量上升幅度低于SB, RB根中Pro的含量高于SB, SB根中膜脂过氧化程度大于RB。铝胁迫下RB根中的SOD活性明显高于SB,约为是SB4倍,CAT活性在RB和SB的根中均被诱导显著升高,POD活性在RB根中有下降趋势,但仍然显著高于SB,约为SB的5倍。用100,200,300和400μmol·L-1Al溶液处理RB和SB后,根用品红亚硫酸溶液染色,结果表明随着铝处理浓度的增加,RB和SB根的着色程度越深,但SB着色程度更甚,铝胁迫下SB根尖醛类物质含量高于RB, HPLC分析结果也表明随着铝处理浓度的增加,RB和SB根中醛的含量都增加,SB增加量幅度更大。铝胁迫下,RB保护酶活性高于SB,使其膜脂受氧化损伤的程度低于SB,产生更少有害的醛类物质,抗氧化酶系统在RB抗铝机制中发挥重要作用。通过RT-PCR方法从丹波黑大豆根中扩增出GmALDH3-1,构建原核表达载体pGEX-4T-1-ALDH3-1.在大肠杆菌中表达重组质粒,确定表达最优条件为28℃诱导6小时,IPTG的浓度对重组蛋白表达影响不大。纯化重组蛋白制备抗体。用添加有1.0.1.5、2.0mmol.L-1IAl3+;2.0、2.25.2.5mmol.L-1Cu2+;0.6、0.8、1.0mmol.L-1Cd2+不同浓度的金属离子的液体LB培养基培养pGEX-4T-1-ALDH3-1转化菌和pGEX-4T-1对照菌,检测转化菌和对照菌的生长曲线,结果表明ALDH3-1转化工程菌对各金属离子都具有耐受性。用含有0、0.1、0.2、0.3、0.4mmol.L-1不同铝离子浓度的GM固体培养基对pGEX-4T-1-ALDH3-1转化菌和对照菌进行培养,培养结果表明含有铝离子的GM固体培养基对对照菌抑制更明显,表明转化菌的耐铝能力高于转空载体对照菌。体外实验的结果表明,ALDH蛋白在体外对乙醛具有明显催化作用。构建植物表达载体pK2-35S-GmALDH3-1,转染烟草,在转录、基因组及蛋白表达水平检测转基因植株,筛选获得阳性表达植株。对转基因烟草进行耐铝生理特性分析,结果表明50μmol·L-1AlCl3胁迫处理24h后,转基因株系根的相对伸长率为野生型1.3倍；可溶性糖为野生型的1.4倍；转基因株系根中MDA. H2O2含量下降,转基因烟草根中各物质含量大约分别是野生型株系的0.5、0.7倍：根中Pro含量高于野生型,约为野生型的1.3倍；转基因株系根中CAT、SOD活性相比分别是对照组的1.3和1.2倍。品红亚硫酸溶液染色实验结果表明,铝处理下野生型根着色程度比转基因株系深,野生型在根尖积累了更多的醛类。HPLC分析,结果也表明铝胁迫下,野生型烟草根中醛的含量高于转基因烟草。铝胁迫下转基因烟草通过降低膜脂过氧化水平、减少根系中醛类物质的含量,维持植物体内渗透压稳态减少氧化损伤,提高转基因烟草的耐铝能力。