葡萄ACS基因启动子的克隆及活性分析

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逆境胁迫会严重影响植物的生长发育,进而导致作物产量下降及品质降低。乙烯作为一种重要的内源信号分子,在植物响应逆境胁迫过程中发挥着十分重要的作用,ACC合成酶是乙烯生物合成途径中专一催化S-腺苷甲硫氨酸合成1-氨基环丙烷-1-羧酸的关键限速酶,它在植物组织内的产量和活性往往决定乙烯产生的速率,因此研究ACC合成酶基因表达调控的分子机制十分必要。本研究以欧洲葡萄叶片为材料,克隆了VvACS5和VvACS7基因启动子,分析了两个基因启动子的顺式作用元件,并研究了顺式作用元件对启动子活性的影响,具体结果如下:1.利用普通PCR技术扩增得到了VvACS5和VvACS7基因启动子序列,长度分别为1019bp和1103bp。利用PLACE和PlantCARE在线数据库分析了两个基因启动子中含有的顺式作用元件,发现存在多种参与植物逆境响应相关的顺式作用元件,如ABRE、ERE、TGACG-motif、CGTCA-motif、P-box、TATC-box、MBS、TC-rich等。2.设计带有酶切位点特异性引物,对VvACS5和VvACS7基因启动子进行5’缺失克隆。将克隆的7条长度不等的5’缺失片段分别与pBI-221-LUC融合,构建7个带有长度不等的缺失片段的表达载体。3.利用PEG-Ca2+介导法,将7个重组表达载体转染野生型拟南芥原生质体细胞中,检测报告基因LUC表达量,并分析启动子的活性。结果显示VvACS5和VvACS7基因启动子均能够驱动下游报告基因LUC的表达,同时发现VvACS5基因启动子中存在对下游基因表达起到促进作用的两个激活区域(-1015-717,-717-269);VvACS7基因的启动子中存在对下游基因表达起到促进作用的一个激活区域(-364-139)和起到抑制作用的两个抑制区域(-848-648,-648-364)。综上所述,本研究克隆得到了2个VvACS基因启动子序列,初步确定了VvACS基因启动子中顺式作用元件的种类和特性,构建了7个带有5’缺失片段的表达载体。利用瞬时表达系统检测报告基因表达量,分析启动子活性。上述实验结果为进一步研究VvACS基因表达调控奠定理论基础,为培育高抗性葡萄植株提供理论参考。
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