论文部分内容阅读
丙酸发酵过程中,产物丙酸的积累对丙酸杆菌具有强烈的反馈抑制作用,导致微生物发酵法生产丙酸的产量低,无法满足工业生产的要求。在了解微生物耐酸机制的基础上提出理性的调控和改造策略可以有效提高微生物的耐酸性,并进一步提高丙酸产量。本文以产酸丙酸杆菌的野生菌株和通过基因组改组获得的耐酸菌株为研究模型,结合基因组学、转录组学、蛋白组学和代谢组学等研究方法,分别在基因和蛋白表达、代谢调控、胞内微环境等水平上阐明了产酸丙酸杆菌丙酸胁迫应答机制,在此基础上通过代谢工程定向改造代谢途径,进一步了提高丙酸杆菌的耐酸性和丙酸产量。此研究结果对微生物耐酸机制的研究和有机酸发酵过程的优化具有一定的指导意义。主要研究结果如下:（1）以产酸丙酸杆菌野生菌Propionibacterium acidipropionici CGMCC 1.2230为出发菌株,利用基因组改组技术筛选获得三株耐酸突变株。对野生菌株和改组菌株P.acidipropionici WSH1105进行基因组测序,通过比较基因组结构的差异发现氨基酸代谢和转运系统对产酸丙酸杆菌的丙酸耐受性有较大影响。进一步采用RNA-seq技术对产酸丙酸杆菌野生菌株和改组菌株的转录组进行比较,分析中性环境和酸性环境下两株菌中的差异表达基因对产酸丙酸杆菌的代谢调控的影响,发现产酸丙酸杆菌的丙酸合成途径中辅酶A类物质的代谢与其细胞的耐酸密切相关。（2）在相同条件下对P.acidipropionici CGMCC 1.2230和P.acidipropionici WSH1105进行基于二维电泳技术的蛋白组学研究。其中24个蛋白在耐酸突变株中的表达量与野生菌株存在显著差异,经鉴定为参与中心代谢途径与酸的应激响应的关键元件。细胞膜相关蛋白通过大量合成能量调节物质的跨膜运输,维持胞内外pH的动态平衡;菌体的生长代谢活性经中心碳代谢途径的酶调节,维持能量和前体物质的供应和氧化还原平衡;参与调节基因的转录、翻译和后修饰的蛋白构成产酸丙酸杆菌响应酸胁迫的DNA修复和保护机制。通过反转录定量PCR（qRT-PCR）进一步确定了9个关键蛋白的表达差异;在大肠杆菌中过量表达关键耐酸蛋白在不同程度上提高了菌株的耐酸性能。（3）为进一步挖掘影响丙酸合成的关键代谢节点,在代谢物和代谢途径水平阐述产酸丙酸杆菌的丙酸合成调节机制,对P.acidipropionici CGMCC 1.2230和P.acidipropionici WSH1105进行基于LCMS-IT-TOF分析的代谢组学研究。共鉴定获得在两株菌中含量差异2倍以上的胞内代谢物142种,并且根据其对代谢的潜在影响对参与丙酸合成途径的关键代谢物的调节功能进行了预测与分析。结果显示,糖酵解途径、Wood–Werkman循环和氨基酸代谢的中间体在产酸丙酸杆菌野生菌与改组菌中的含量有显著差异。在比较代谢组学分析的基础上提出了外源添加关键代谢物及通过基因敲除削弱副产物合成途径的策略,在优化的条件下产酸丙酸杆菌的丙酸产量分别从23.1 g?L-1提高至35.8 g?L-1和27.4 g?L-1,提高了55.0%和18.6%。（4）通过比较分析P.acidipropionici CGMCC 1.2230和P.acidipropionici WSH1105在中性和酸性条件下的胞内生理状态差异,在微环境水平揭示了产酸丙酸杆菌的丙酸胁迫调控机制。考察的因素包括胞内pH、NAD+/NADH比、H+-ATPase比活力和胞内氨基酸浓度。低pH激活产酸丙酸杆菌的质子泵（H+-ATPase）系统将胞内质子（H+）泵出胞外,从而维持较高的胞内pH,还原力水平也因此有所提高;同时,细胞内的精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸浓度提高,分别通过代谢消耗胞内质子、生成碱性物质和ATP以提高细胞的耐酸性。基于以上分析,在厌氧瓶中外源添加氨基酸以考察其对菌体耐酸和产酸的影响,通过添加20 mM精氨酸和天冬氨酸最多可使丙酸产量从10.28 g?L-1提高至14.38g?L-1,提高39.9%。（5）通过代谢工程手段过量表达耐酸元件可显著提高詹氏丙酸杆菌细胞抗逆性能和丙酸合成效率。在詹氏丙酸杆菌中过量表达五个编码精氨酸脱亚胺酶系统和基于谷氨酸的耐酸系统的酶的基因。五个酶在相应工程菌中的酶活比野生菌提高了26.7-489%;与野生菌相比,工程菌的生长减慢,而丙酸生产能力提高。其中gadB（编码谷氨酸脱羧酶）的过量表达对提高丙酸耐受性和产量最有效,其丙酸耐受性比野生菌提高了10倍以上,丙酸浓度、产量和转化率分别由8.86 g?L-1、4.78 g?L-1、0.46 g?g-1提高到10.81 g?L-1、5.92g?L-1、0.56 g?g-1,提高了22.0%、23.8%和21.7%。另外,研究分别从耐酸元件相关代谢途径的关键酶的转录和胞内氨基酸含量的水平上考察了耐酸元件的引入对细胞的影响。