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目的:2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是由遗传和环境因素共同作用所致的代谢性疾病,发病机制复杂。流行病学调查显示,遗传基因在糖尿病及其慢性并发症的发生发展中起到了重要作用,对糖尿病易感基因的研究是近年来糖尿病遗传机制研究的重点和热点。T2DM慢性并发症中大血管病变病情重、死亡率高,其病理改变的基础是动脉粥样硬化(arteriosclerosis,AS)。目前研究表明,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化酶来源的活性氧(reactive oxygen species,ROS)与糖尿病和AS的发生发展密切相关,而p47phox是NADPH氧化酶系统的主要成份,在中性粒细胞和血管系统ROS的产生过程中发挥了重要作用。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)作为研究疾病基因多态性的新工具,广泛应用于定位多基因疾病的主要致病基因及进行发病机理的研究。目前对p47phox基因SNP与T2DM关系的研究较少。ROS在体内过度蓄积,氧化应激水平超出体内抗氧化能力时会造成DNA的氧化损伤。8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine,8-OHd G)可以反映整个机体平均的氧化损伤率及体内DNA氧化损伤与机体的正常修复作用,其在人体的含量稳定且灵敏度高,是评价氧化应激强度的最佳指标。本研究旨在通过研究p47phox基因SNP与T2DM及其大血管病变的关系,从分子水平探讨其发病机制,为预防和治疗提供理论依据;同时观察T2DM患者血清8-OHd G水平,明确在T2DM及其大血管病变发生中NADPH氧化酶起到的作用。方法:按1999年WHO提出的T2DM诊断标准,选择没有血缘关系的T2DM患者共300例,按是否合并大血管病变分成单纯T2DM组156例,男90例,女66例,最大年龄77岁,最小年龄31岁,平均年龄51.6±10.0岁,平均病程4.2±1.3年;T2DM大血管病变组144例,男84例,女60例,最大年龄76岁,最小年龄28岁,平均年龄55.0±11.3岁,平均病程10.6±2.3年。正常对照组:为同期我院医务人员及常规体检人群中健康个体140例,男85例,女55例,最大年龄76岁,最小年龄36岁,平均年龄53.0±9.1岁,无心、脑、肝、肾脏病史。受试者禁食12小时,空腹抽取两管4ml静脉血,一管用乙二胺乙酸抗凝,用于提取基因组DNA,另一管分离血清,用于生化指标和8-OHd G的检测,静脉血和血清均于-20℃冰箱保存。1临床指标的测定1.1测定身高、体重、腰围、臀围、收缩压(systolic blood pressure,SBP)、舒张压(diastolic blood pressure,DBP)和踝动脉压,计算体重指数(body mass index,BMI)=体重/身高2、腰/臀(waist-to-hip ratio,WHR)=腰围/臀围和踝肱指数(Ankle brachial pressure index,ABI)=踝动脉收缩压/肱动脉收缩压。1.2应用全自动生化分析仪测定空腹血糖(fasting blood-glucose,FBG)、甘油三酯(triglycerides,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)及高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)。1.3用免疫比浊法测定糖化血红蛋白(hemoglobin A1c,Hb A1c)。2酶联免疫吸附法测定8-OHd G的水平。3 NADPH氧化酶p47phox基因G338A多态性的检测3.1人基因组DNA样品的制备:用血液基因组DNA小量提取试剂盒(由上海捷瑞生物工程有限公司提供)提取乙二胺乙酸抗凝血外周血基因组DNA,然后分光光度仪测定DNA溶液浓度和纯度。3.2聚合酶链反应(PCR):扩增模板为外周血白细胞基因组DNA,上、下游引物序列分别是:5’-TCCCAAGTGGTTTGACGG-3’、5’-CCTCCTCTTTCTGGCTGTG-3’,25μl反应体系含基因组DNA2μl,上下游引物各1μl,PCR Premix 12.5μl,灭菌蒸馏水8.5μl。反应条件:94℃预变性3分钟,94℃变性30秒,54℃退火30秒,72℃延伸40秒,共35个循环,循环结束后72℃延伸3分钟,反应管4℃冷却10分钟。然后将PCR产物纯化,将纯化后的PCR产物在测序仪上测序。4统计学处理:应用SPSS19.0软件处理所有数据,以P<0.05为差异有统计学意义。对计量资料进行正态性检验,结果用均数±标准差(±Χs)表示;各组基因频率的群体代表性用Hardy-Weinberg平衡法检验;计量资料的组间比较用方差分析;计数资料的组间比较用X2检验;8-OHd G浓度与其他因素的相关性分析采用Spearman或Pearson相关分析;用logistic逐步回归分析T2DM大血管病变发生的危险因素,以P<0.05定义为选入标准,P>0.10为剔除标准。结果:1 T2DM组与正常对照组的年龄、性别、BMI的构成比无显著性差别,具有可比性;单纯T2DM和T2DM大血管病变组的吸烟史、WHR、SBP、DBP、TC、TG、LDL-C及FBG水平显著高于正常对照组(t分别为-1.563、-1.793、-2.474、-2.296、-1.952、-1.504、-2.261、-7.191和-1.784、-2.410、-2.774、-2.576、-1.569、-1.752、-2.710、-8.675,均P<0.05),HDL-C水平低于正常对照组(t分别为2.183和4.224,均P<0.05);T2DM大血管病变组的糖尿病病程、吸烟史、WHR、SBP、DBP、TG、LDL-C、FBG及Hb A1c水平显著高于单纯T2DM(t分别为-2.681、-2.716、-3.328、-3.002、-2.863、-3.619、-2.299、-1.979和-2.037,均P<0.05),ABI、HDL-C水平低于单纯T2DM组(t分别为1.913和1.863,均P<0.05)。单纯T2DM组8-OHd G水平(6.41±2.04ng/ml)较正常对照组(4.16±2.11ng/ml)明显升高(t=-4.662,P<0.05),大血管病变组(7.88±2.80ng/ml)明显高于单纯T2DM组和正常对照组(t分别为-3.215和-6.354,均P<0.05)。2 8-OHd G与糖尿病病程、吸烟史、TC、FBG及Hb A1c呈显著正相关(r分别为0.324、0.337、0.172、0.213和0.328,均P<0.05),与ABI和HDL-C呈显著负相关(r分别为-0.383和-0.173,均P<0.05),与年龄、BMI、WHR、TG和LDL-C无显著相关性。3正常对照组、单纯T2DM组、T2DM大血管病变组GA+AA基因型频率分别为7.14%、21.15%和29.17%,A等位基因频率分别为3.57%、11.54%和15.97%。比较各组GA+AA基因型频率和等位基因A频率,单纯T2DM组和T2DM大血管病变组均高于正常对照组(X2分别为11.665、23.020和13.070、24.566,均P<0.05),单纯T2DM组和T2DM大血管病变组间无显著性差异(X2分别为2.564和2.495,P分别为0.109和0.114)。4与GG型相比,GA+AA型的高血压病史、BMI、SBP、DBP、FBG、Hb A1c及8-OHd G升高(t分别为-2.163、-2.090、-2.624、-3.011、-2.870、-1.989和-2.037,均P<0.05),ABI降低(t=2.184,P<0.05)。两组间年龄、性别、病程、冠心病病史、脑卒中病史、WHR、TC、TG、LDL-C和HDL-C无显著差别(P>0.05)。GA+AA型大血管病变发生率为49.4%,高于GG型大血管病变发生率的28.7%(X2=13.32,P<0.05)。5在T2DM患者中,有无大血管病变作为因变量进行逐步回归分析,结果显示糖尿病病程、SBP、ABI、LDL-C及8-OHd G是大血管病变的独立危险因素(β分别为0.227、0.484、-1.162、1.756和0.224,均P<0.05)。将T2DM大血管病变组患者根据是否合并高血压进行分组后再比较,发现T2DM大血管病变合并高血压患者中,糖尿病病程、ABI、LDL-C、8-OHd G和等位基因A是其独立危险因素(β分别为0.534、-0.765、1.467、0.526和0.509,均P<0.05)。结论:1 T2DM患者血清8-OHd G水平升高,提示其体内存在氧化应激,并且T2DM大血管病变者较单纯T2DM患者更显著。2 T2DM患者血清8-OHd G水平与NADPH氧化酶G338A基因多态性相关,A等位基因携带者血清8-OHd G水平较高,后者是T2DM大血管病变的危险因素。3 p47phox亚基G338A基因多态性可能与T2DM大血管病变的易感性无关,338A等位基因不是T2DM大血管病变的易感基因,但是T2DM大血管病变合并高血压的独立危险因素。