研究背景乳腺癌是癌症死亡的第二大常见原因,也是女性中最常见的癌症。据估计,2020年全球新增乳腺癌病例为2261419例,约占所有癌症类型所有病例的11.7%,甚至超过了肺癌、前列腺癌和结直肠癌等。其中25%-30%的乳腺癌患者中,肿瘤细胞表面过表达表皮生长因子受体2（Human Epidermal Growth Factor Receptor type 2,HER2）,称为HER2过表达型,具有侵袭性高、发展快、预后差及易转移复发的特点。临床研究表明,靶向治疗能够有效地抑制HER2过表达型乳腺癌肿瘤生长,提高治愈率。1998年,美国食品和药物管理局（FDA）批准曲妥珠单抗（赫赛汀,Herceptin?）作为首个针对乳腺癌的抗体靶向疗法。近年来,HER2阳性乳腺癌的临床试验证实,在转移性和辅助治疗的情况下,与单独化疗相比,初始曲妥珠单抗联合化疗可延长疾病进展时间和总生存期[1]。然而针对HER2阳性乳腺癌的治疗仍然面临耐药及副作用的诸多难题[2,3]。紫杉醇（Paclitaxel,PTX）作为Herceptin经典联合化疗药物的代表,是当今使用最多的传统化疗药物之一,但它的水溶性非常有限（＜0.03 mg/m L）。传统化疗药物的水溶性及靶向性较差,对正常细胞杀伤作用较大,从而导致常规联合化疗用药会进一步增加毒副作用及不良反应的发生。因此,如何提高传统化疗药物的水溶性,同时进一步提高此类化疗药物的靶向性及降低常规联合序贯用药的毒副作用及不良反应仍是亟需解决的难题。此外,研究表明,协同靶向可进一步增强抗肿瘤药物的靶向释放效果,同时降低两者的毒副作用,提高疗效[4,5]。研究目的1.合成一种具有潜在临床应用价值的新型协同靶向联合化疗药物Her-HINP/PTX,以减少单独用药及常规联合用药所致的耐药及毒副作用,提高治疗效果。对其进行一系列表征,并评估其水溶性、稳定性,计算载药率和包封率。2.评估Her-HINP/PTX对透明质酸酶的体外响应性:酶响应后形态及粒径尺寸的变化、药物释放效率及响应后荧光强度的变化情况。3.研究Her-HINP/PTX的生物相容性、对HER2表达水平不同的肿瘤细胞的靶向性及细胞毒性。4.探讨Her-HINP/PTX的体内响应性,评价其抗肿瘤效果及体内生物安全性。研究方法1.首先构建协同靶向联合化疗药物载体HINP,通过物理包埋的方式将疏水性化疗药物PTX装载到HINP的疏水核心中,最后利用Herceptin末端的-NH2与HINP/PTX表面的-COOH,在EDC/NHS作用下通过脱水缩合反应共价结合生成Her-HINP/PTX。通过~1H-NMR确定每一步的产物。应用TEM、DLS及FLS 980荧光光谱仪分别表征其形态、粒径、电位及吸收和发射光谱。将终产物Her-HINP/PTX分别分散到超纯水、PBS和含10%热灭活胎牛血清的DMEM培养液中,在37℃下保存。在分散后的不同时间对样本进行数码拍照并用DLS测量纳米颗粒大小来评估其水溶性及稳定性。利用高效液相色谱法（HPLC）测定PTX的包封率及载药率,BCA蛋白定量法测定单克隆抗体Herceptin的偶联率。2.将适量的协同靶向联合化疗药物Her-HINP/PTX分散在PBS中并加入透明质酸酶（0.1 mg/m L）,在37℃,100 rpm条件孵育箱中孵育后,通过TEM和DLS研究其体外透明质酸酶响应后形态和大小的变化。通过FLS 980稳态瞬态荧光光谱仪及近红外二区小动物活体成像系统In-vivo Master记录酶响应后荧光光谱及荧光强度的变化。利用透析法测定酶响应性PTX释放效率。3.为了研究Her-HINP/PTX的靶向性,我们选用HER2表达情况不同的两种乳腺癌细胞SK-BR-3（HER2高表达）、MDA-MB-231（HER2阴性）及正常肝脏L02细胞,分别用荧光染料标记的Her-HINP和HINP进行处理。为了进一步验证Herceptin对HER2及HA对CD44的靶向性,我们在SK-BR-3乳腺癌细胞中设置了HA阻断组、Herceptin阻断组及HA+Herceptin双阻断组。细胞核和溶酶体染色后用CLSM观察不同材料进入细胞的情况。在细胞毒性实验的研究中,我们对HER2表达情况不同的两种乳腺癌细胞SK-BR-3（HER2高表达）、MDA-MB-231（HER2阴性）及正常肝脏L02细胞都进行了研究,实验分为6组,Herceptin组、PTX组、HINP组、Her-HINP组、HINP/PTX组和Her-HINP/PTX组,我们分别用100、50、10、1、0.1、0.01、0.001μg/m L的药物浓度进行毒性研究,之后用CCK8试剂盒监测细胞活力,并使用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒对HER2高表达的SK-BR-3乳腺癌细胞各实验组的凋亡情况进行进一步的研究。4.构建SK-BR-3荷瘤裸鼠模型,当肿瘤生长至80 mm~3左右时,随机分为2组:Her-HINP/PTX组和HINP/PTX组（每组n=3）,分别经尾静脉注射200μL（PTX=5 mg/kg）。尾静脉注射后的6 h、12 h、24 h、36 h、48 h在异氟醚麻醉下应用NIR-Ⅱ小动物活体成像系统In-vivo Master进行体内荧光信号监测,以观察两组化疗药物在荷瘤裸鼠体内的分布和瘤内累积情况。同样使用SK-BR-3荷瘤裸鼠模型进行抗肿瘤效果的评估。将荷瘤裸鼠随机分为以下7组:Her-HINP/PTX组、HINP/PTX组、Herceptin组、Her-HINP组、PTX组、HINP组、生理盐水组,每组5只。分别监测肿瘤大小、荷瘤小鼠体重,并在治疗20天后处死小鼠,摘取各治疗组小鼠的主要器官进行HE染色组织学分析,评估各治疗组的抗肿瘤效果及体内生物安全性。研究结果1.成功合成新型协同靶向联合化疗药物Her-HINP/PTX,其具有良好的水溶性和稳定性。PTX:HINP（w/w）为30%时具有较高的包封率及载药率,分别为75.4±0.15%、29.5±0.06%。Herceptin的抗体偶联率为27.5%,载药率为6.6%。2.在体外与透明质酸酶孵育后,单分散的Her-HINP/PTX变为多分散性,并且粒径从163.0±6.1 nm显著变化到53.2±7.5 nm和228.6±14.1 nm。在透明质酸酶的刺激下,其在血清环境中的尺寸变化与在PBS中相似,单分散的Her-HINP/PTX的尺寸由141.8±1.7nm变化到38.6±17.0 nm和174.7±18.5 nm。说明血清环境几乎不影响Her-HINP/PTX对透明质酸酶的响应性。此外,TEM显示在透明质酸酶作用下,Her-HINP/PTX由球形转变为不规则形态,与DLS结果保持一致。这些结果表明,用透明质酸酶断裂透明质酸链可以有效地使Her-HINP/PTX解离。Her-HINP/PTX在被解离后IR-1048的荧光强度增强。PTX的释放量较无透明质酸酶实验组明显增加。3.体外生物相容性研究中,1600μg/m L的浓度下未观察到明显的溶血反应,说明Her-HINP/PTX的生物相容性良好。在细胞靶向性实验研究中,HER2高表达的SK-BR-3细胞可以大量摄取Her-HINP,且能够被HA、Herceptin双重阻断,而对HINP的摄取量较低,说明协同靶向联合化疗药Her-HINP/PTX具有良好的CD44、HER2双靶向作用。通过对HER2阴性的MDA-MB-231细胞和正常肝脏L02细胞的研究进一步证明了Her-HINP/PTX的双靶向作用。在细胞毒性研究中,Her-HINP/PTX对HER2阳性肿瘤细胞具有良好的杀伤作用。Her-HINP/PTX实验组中细胞存活率随着其浓度的提高而明显降低,仅有23.96±2.59%的细胞在100μg/m L（PTX药物浓度）的浓度下保持存活。细胞凋亡实验中Her-HINP/PTX组的细胞凋亡率也达到了69.45%,进一步说明Her-HINP/PTX在体外具有良好的抗肿瘤效果。4.Her-HINP/PTX经尾静脉注射后在肝脏及肿瘤部位大量积累,其荧光信号在给药后24 h达峰值,其他组织器官中未见明显的荧光信号。在SK-BR-3荷瘤裸鼠的治疗中,Her-HINP/PTX治疗组肿瘤的生长受到明显的抑制,通过组织学分析并未观察到明显的毒副作用。结论本研究成功构建了新型协同靶向联合化疗药物Her-HINP/PTX,其具有良好的水溶性、稳定性、生物相容性及透明质酸酶响应性。通过HA构建的纳米药物载体将疏水性化疗药物PTX包封到纳米颗粒疏水性核心中,不仅增加了PTX的水溶性及生物相容性。同时,酶响应性PTX的释放也减少了传统化疗药物PTX的全身性毒副作用。该纳米载体中HA独特的CD44靶向能力及良好的生物相容性的优势使该纳米药物递送载体具有良好的研究及应用前景。在该体系中引入的近红外二区荧光分子IR-1048,在肿瘤部位被透明质酸酶解离后的荧光信号可用来监测肿瘤部位药物的聚集情况,从而可以较早的评估治疗效果。此外,在该纳米药物递送载体的基础上,我们又引入了靶向分子,Herceptin的加入使得该纳米药物具有CD44和HER2双靶向作用。纳米材料的EPR被动靶向作用及对CD44和HER2的主动靶向作用,使化疗药物更加精准的到达肿瘤细胞,实现靶向给药,增加化疗药物在肿瘤部位的投放效率,提高治疗效果,从而达到精准治疗的目的。