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p53是调控细胞周期进程及凋亡发生的蛋白网络的重要节点分子,它作为一种重要的转录因子,在感应DNA损伤、细胞异常增殖和原癌基因激活等不同类型的细胞应激时,其活性迅速增强,能够诱导细胞周期阻滞和/或细胞凋亡的发生。KRAB锌指蛋白(又称作KZNF)家族是哺乳动物中最大的转录调控因子家族,Apak(ATM and p53 associated KZNF protein)是这个家族中的成员之一。Apak作为本实验室发现的一种p53负调控分子,能够选择性地下调凋亡相关的p53靶基因表达,抑制p53介导的细胞凋亡,而对细胞周期没有显著调控作用。在非应激条件下Apak通过募集KAP-1/HDAC1/ATM复合物抑制p53的乙酰化,从而发挥对p53的负调控功能。而在DNA损伤条件下,Apak被ATM磷酸化并因此与p53解离,解除对p53的抑制,促使p53激活,诱导细胞凋亡发生。癌基因的激活是一类重要的p53诱导信号,也是导致肿瘤发生的重要因素,其信号转导机制不同于DNA损伤信号通路。目前已知,癌基因激活后很大程度上是通过上调抑癌基因p14ARF的转录水平和/或活性而间接诱发p53激活的。本实验室新近克隆和鉴定了Apak基因,但目前关于Apak基因的研究报道还非常少,它在不同类型细胞应激条件下的调控机制也还很不清楚。为此,本论文研究了Apak在癌基因激活及多种化疗药物造成的DNA损伤这两大类细胞应激条件下的功能调控及其分子机制。取得了以下结果:1.在癌基因激活条件下Apak功能的变化(1)在利用过表达c-MYC、E2F1、Ras-G12V模拟的原癌基因激活条件下,Apak和p53发生解离并且解除了对p53的抑制,且这些过程依赖于p14ARF,但不依赖于ATM介导的磷酸化。(2)蛋白相互作用实验显示,p14ARF与Apak在体内体外均可结合,且p14ARF能够与p53竞争性的结合Apak,从而诱发p53与Apak解离。同时还发现,原癌基因激活可诱导Apak蛋白稳定性显著增加,且依赖于p14ARF的表达。(3)Apak为短寿命蛋白,其稳定性受到泛素蛋白酶体系统的调节,泛素连接酶(E3)HDM2和ARF-BP1参与了Apak泛素化降解,而原癌基因激活可诱导p14ARF上调表达,后者抑制了这两种E3对Apak的降解作用,从而增强其蛋白的稳定性。(4)敲低HDM2和ARF-BP1的表达,可干扰p14ARF诱导的Apak上调。这些结果揭示了一条从原癌基因激活到p14ARF再到Apak的信号转导通路。2.在7种不同的化疗药物处理下Apak的功能变化发现在经典的DNA损伤信号如顺铂(cisplatin)、阿霉素(doxorubicin)、鬼臼亚乙苷(etoposide)、喜树碱(camptothecin)处理下,Apak能够被ATM磷酸化并与p53解离。而5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)、放线菌素D(actinomycin D)和硫辛酸(α-lipoic acid,α-LA)则没有这样的效应。这表明Apak响应特定类型的DNA损伤信号。