微生物污染是乳品品质降低的重要原因,从牧场采集到的原料乳,在运往奶厂加工前,会在4oC冷链下贮存数小时,以限制微生物的生长。假单胞菌是原料乳中代表性嗜冷菌,具有很高的遗传和代谢多样性,尤其是显著的低温生长能力和水解酶活性,频繁污染并导致乳制品质量缺陷。值得注意的是,牧场环境因素会影响假单胞菌的菌群结构,并且由于种间代谢差异,引起原料乳不同程度的腐败风险。因此,对其致腐败能力差异比较和菌群结构分析检测,成为原料乳腐败危害防控的关注焦点。过往假单胞菌导致牛乳腐败的研究中,该属常被作为一个整体或者单独研究了代表性菌株,或是重点关注到了几个主要的种,未曾有对不同种之间的生理特性、牛乳理化性质造成影响以及与腐败相关的代谢通路的系统比较探究。且针对假单胞菌的检测手段,还未开发出假单胞菌复杂样本中假单胞菌种水平的检测方法。基于该研究现状,本课题比较了常见假单胞菌在牛奶致腐败过程中存在的种间差异,开发出一种覆盖到属内全部种的高通量测序方法,以揭示牧场环境因素与假单胞菌结构的关联性,并开发出相应的预测模型。该研究比较不同种腐败假单胞菌的腐败作用方式、分析原料乳加工过程中假单胞菌菌群结构的变化规律,为从源头减少假单胞菌的危害、保障乳品质量提供了有力手段。课题研究内容和结果如下:首先,分离鉴定了原料乳中的多种假单胞菌,通过测定在含乳和非乳条件下菌株低温生长能力、水解酶活性、耐热性,以及牛乳的p H值、粒径和Zeta电位方面的变化评估对牛乳理化性质的影响。实验结果表明,大部分种表现出了在乳环境中更好的低温生长能力,低温酶活和酶的热稳定性也具有显著的种间差异。对p H和乳液稳定性影响在低温贮存48 h之后出现差异。进一步,对荧光假单胞菌、莓实假单胞菌在乳低温发酵中产生的风味口感进行比较,对游离氨基酸、挥发性物质变化进行分析,发现酪氨酸、精氨酸、缬氨酸以及安息香醛、3-甲基吲哚可能作为荧光假单胞菌腐败的靶标物质;而半胱氨酸和2,4-二叔丁基苯酚可以作为莓实假单胞菌的靶标物质。最后,借助蛋白组和代谢组的手段,从物质和通路角度解析了两菌种的差异原因。两个种的差异代谢物主要集中在乙基丙二酸、L-苯丙氨酸、硬脂酰胺以及5-羟色胺等物质方面;此外,荧光假单胞菌的污染会导致更高的疾病风险。另一方面,通过对假单胞菌的全基因组进行比较基因组,结合生物信息学分析,筛选出具有种水平鉴别潜力的靶标基因mre B,并基于该基因构建了假单胞菌种水平Illumina Mi Seq测序技术。对检测方法的评价结果显示,该方法对假单胞菌具有很好的鉴别能力。通过模拟混合样本实验进一步确定的检测结果与实际结果有很好的一致性（y=1.022x-0.088,R~2=0.9957）,且方法的有效检测限为2.45 log CFU/m L。进一步,我们将该技术应用于原料乳的高通量分析中,结合16S r DNA测序结果,分析了多种来源原料乳中的菌群结构。样本和组间分类学组成分析、多样性分析以及差异菌种分析揭示了假单胞菌结构和在最优次优贮存温度、贮存时间、加工位点以及牧场环境中的组成结构差异。在4oC下,优势菌种主要有荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌和门多萨假单胞菌等,7oC的优势菌种主要有荧光假单胞菌、耐冷假单胞菌以及浅黄假单胞菌。针对不同采样点的样本分析,隆德假单胞菌表现出消毒剂处理和低温贮存后的优势。同时,不同牧场环境的菌种结构也有差异。最后,迁移学习了一项菌群结构预测的机器学习手段,成功实现基于牧场环境因子对假单胞菌菌群结构组成的预测模型构建。该研究为防控假单胞菌对原料乳等食品的危害提供了新的研究角度和技术手段。