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第一部分 皮肤鳞状细胞癌中细胞焦亡情况的研究[目 的]明确皮肤鳞状细胞癌、光线性角化病中细胞焦亡水平情况,分析细胞焦亡在皮肤鳞状细胞癌中可能存在的作用。[方法]1、随机选择正常皮肤、光线性角化病（AK）、皮肤鳞状细胞癌（SCC）样本组织分为三组,每组6例,采用荧光定量PCR技术检测三组组织中TLR4、CPB1、NLRP3、IL-1β、IL-18的mRNA表达情况,蛋白免疫印迹法检测三组组织目的蛋白的表达及免疫微环境的炎症因子等的活化情况。2、随机选择正常皮肤、光线性角化病、皮肤鳞状细胞癌组织三组石蜡切片,每组5例,采用免疫荧光技术检测TLR4的表达情况;并对三组切片进行TLR4/TUNEL双染,用荧光显微镜来观察细胞焦亡的不同对比情况。[结 果]1、SCC中细胞焦亡TLR4信号通路的相关因子包括TLR4、CPB1、NLRP3的mRNA表达情况均高于正常组,同时炎症因子IL-1β、IL-18的mRNA表达增加;AK中细胞焦亡TLR4信号通路的相关因子包括TLR4、CPB1、NLRP、IL-1β、IL-18的mRNA表达情况均高于正常组,且SCC组织中TLR4、CPB1、NLRP3、IL-1β、IL-18的mRNA表达情况均高于AK组织。与正常组织相比,SCC中细胞焦亡TLR4信号通路相关因子TLR4、CPB1、NLRP3、IL-1β、IL-18的蛋白表达增加;与正常组织相比,AK组织中相关因子TLR4、CPB1、NLRP3、IL-1β、IL-18的蛋白表达增加;与AK组织相比,SCC中细胞焦亡TLR4信号通路相关因子 TLR4、CPB1、NLRP3、IL-1β、IL-18 的蛋白表达增加。2、免疫荧光检测可见SCC中细胞焦亡中相关因子TLR4的表达较正常组中明显上调,AK组与正常组相比TLR4的表达上调,且SCC组与AK组相比TLR4的表达上调。TLR4及TUNEL双染可观察到:同正常组相比,SCC中细胞焦亡的表达增加,AK中细胞焦亡的表达增加,且SCC组细胞焦亡的表达高于AK组。[结论]在皮肤鳞状细胞癌组织中,TLR4信号通路相关因子TLR4、CPB1、NLRP3、IL-1β、IL-18呈现出高表达的状态,提示细胞焦亡中TLR4相关信号通路的高表达在皮肤鳞状细胞癌病变中,可能存在重要的促进疾病发展的作用。第二部分 体外验证紫外线照射对皮肤鳞状细胞癌细胞焦亡相关信号通路的影响[目 的]对人正常角质细胞株HaCaT细胞、人鳞癌细胞株SCL-1细胞分别用LPS诱导、UVB辐照,观察其中涉及到的细胞焦亡的TLR4相关信号通路因子的变化情况,明确紫外线是否通过影响细胞焦亡的表达而促使肿瘤的发生。[方法]1、脂多糖（LPS）可结合跨膜介导蛋白TLR4,从而诱导细胞焦亡的发生,采用不同浓度的 LPS,包括 0.1 ug/ml、0.5ug/ml、1 ug/ml、10ug/ml,诱导人正常角质细胞株HaCaT细胞,培养24h后进行CCK8活力的检测,摸索LPS适宜浓度。2、培养人正常角质细胞株HaCaT细胞、人鳞癌细胞株SCL-1细胞,将其各分为四组,如人正常角质细胞株HaCaT细胞分为:HaCaT细胞、HaCaT细胞+脂多糖LPS、HaCaT细胞+UVB辐照、HaCaT细胞+UVB辐照+脂多糖LPS;人鳞癌细胞株SCL-1细胞分为:SCL-1细胞、SCL-1细胞+脂多糖LPS、SCL-1细胞+UVB辐照、HaCaT细胞+UVB辐照+脂多糖LPS。使用CCK8检测细胞活力;并提取RNA,采用定量PCR检测目的基因及及炎症因子包括（TLR4、CPB1、NLRP3、IL-1β、IL-18）的mRNA表达情况;蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测各组目的蛋白的表达及免疫微环境的炎症因子等的活化情况。免疫荧光技术（IF）检测TLR4的表达情况。[结 果]1、在 0.1 ug/ml、0.5 ug/ml、1 ug/ml、10ug/ml 浓度的 LPS 诱导下,细胞活力同正常组相比有不同程度的下降。HaCaT细胞、SCL-1细胞受到LPS刺激时,其细胞活力情况同正常组相比下降;HaCaT细胞、SCL-1细胞接受单纯UVB辐照刺激,其细胞活力情况同正常组相比无显著差异;HaCaT细胞经UVB辐照后再受到LPS刺激,其细胞活力情况同只接受LPS刺激的HaCaT细胞相比升高,而SCL-1细胞经UVB辐照后再受到LPS刺激,其细胞活力情况同只接受LPS刺激的SCL-1细胞相比无显著差异。2、受到UVB辐照的HaCaT、SCL-1细胞和正常对照组相比,相关因子TLR4、CPB1、NLRP3、IL-1β、IL-18 的 mRNA 表达水平无明显改变。而 HaCaT、SCL-1细胞经UVB辐照再受到LPS刺激后,其细胞焦亡TLR4信号通路相关因子TLR4、CPB1、NLRP3、IL-1β、IL-18的mRNA表达水平对比只受到LPS刺激的HaCaT、SCL-1细胞来说相对下降。3、受到UVB辐照HaCaT、SCL-1细胞,和正常对照细胞组相比,其细胞焦亡TLR4信号通路相关因子TLR4、CPB1、NLRP3、IL-1β、IL-18的蛋白表达水平无明显改变。而HaCaT细胞经UVB辐照再受到LPS刺激后,TLR4、CPB1、NLRP3、IL-1β、IL-18的蛋白表达水平对比只受到LPS刺激的HaCaT细胞来说相对下降。SCL-1细胞经UVB辐照再受到LPS刺激后,对比只受到LPS刺激的SCL-1细胞来说,其细胞焦亡TLR4信号通路相关因子TLR4、CPB1、IL-1β、IL-18的蛋白表达水平相对减少,NLRP3的表达水平无明显差异。4、免疫荧光实验可见HaCaT、SCL-1细胞受到UVB辐照后对比正常对照细胞组TLR4表达无明显改变;而HaCaT、SCL-1细胞经UVB辐照再受到LPS刺激后,对比只受到LPS刺激的HaCaT、SCL-1细胞,TLR4的表达水平下降。[结论]1.单纯UVB辐照并不能造成细胞焦亡TLR4相关通路因子表达改变,表明紫外线的促癌作用并不是直接通过调控细胞焦亡相关TLR4通路发生。2.紫外线辐照在一定程度上抑制了 LPS诱发的细胞焦亡,提示紫外线诱发皮肤鳞状细胞癌可能是与其他调控机制共同调控。