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目的:本研究以尾部具有明显差异的阿勒泰羊（肥臀尾型）和湖羊（短脂尾型）尾部脂肪组织为研究对象,构建急性冷应激下阿勒泰羊和湖羊的mi RNA文库;分析预测急性冷应激后差异表达mi RNA的靶基因以及其相对应的富集通路和生物学功能;筛选两个文库中可能与脂肪代谢相关的差异表达mi RNA,并对其进行验证,为进一步研究mi RNA在脂肪代谢中的作用机制奠定基础,为初步探明寒冷应激下绵羊脂肪代谢的分子机制、培育具有较高抗寒性能的绵羊新品种提供参考依据。方法:本论文共分四个试验,具体方法如下:试验一:采集常温组和急性冷应激组绵羊尾部脂肪组织,标记后存放于配好的10%福尔马林溶液中进行固定,随后采集常温组和急性冷应激组绵羊心脏、肝脏、脾脏和肾脏组织,放入液氮中保存。采用实时荧光定量PCR技术检测绵羊在急性冷应激前后HSP60、HSP70以及HSP90基因在心脏、肝脏、脾脏和肾脏组织中m RNA相对表达量;采用HE染色方法,观察绵羊尾部脂肪组织在急性冷应激前后的形态学变化。试验二:急性冷应激下阿勒泰羊及湖羊mi RNA文库的构建。活体采集常温组阿勒泰羊及湖羊尾部脂肪组织,各三个生物学重复,采集后立即放入液氮中保存。经-25℃,24h冷刺激后,迅速放血屠宰,采集尾部脂肪组织,放入液氮中保存。提取12个样本的总RNA进行质量检测,随后将质检合格的样本进行mi RNA文库构建,利用Illumina Hi Seq TM2500/Mi Seq测序平台测序,对原始数据进行质量检测并通过数据过滤获得高质量数据。试验三:阿勒泰羊及湖羊差异表达mi RNA的筛选鉴定、靶基因预测以及生物信息学分析。使用预测软件mi REvo和mirdeep2等对匹配到的s RNA进行新mi RNA预测,并对匹配到的s RNA进行详细分析。随后筛选差异表达mi RNA,并随机挑选8-9个差异表达mi RNA进行q PCR定量验证其准确性。使用mi Randa、PITA和RNAhybrid三个软件对差异表达mi RNAs进行靶基因预测,利用GOseq和KOBAS软件进行靶基因的基因富集分析,结合查阅大量相关文献,筛选出阿勒泰羊和湖羊文库中与脂肪代谢相关mi RNA。试验四:通过富集分析,以及查阅大量文献,从阿勒泰羊和湖羊文库中各选取一个与脂肪代谢相关的mi RNA,分别是mi R-3957-5p和mi R-370-3p,其预测得到的相对应靶基因分别是多巴胺受体D2（Dopamine receptor D2,DRD2）和去乙酰化酶3（Sirtuin 3,SIRT3）。随后在细胞水平进行双荧光素酶报告基因检测mi R-3957-5p和mi R-370-3p对靶基因DRD2和SIRT3是否具有靶向调节作用。为进一步研究mi R-3957-5p和mi R-370-3p参与调控脂肪代谢奠定基础。结果:试验一:通过显微镜观察绵羊尾部脂肪组织的HE染色切片,急性冷应激前后脂肪组织形态发生变化;HSPs家族基因在绵羊急性冷应激后于不同组织中的表达均发生显著变化。说明成功构建了急性冷应激绵羊模型。试验二:1)总RNA质量检测合格。2)成功构建了6个阿勒泰羊mi RNA文库,6个湖羊mi RNA文库。测序后阿勒泰羊常温组三个样本文库（A1、A2和A3）共获得46591002个原始数据,急性冷应激组三个样本文库（LA1、LA2和LA3）共获得52039709个原始数据。经过数据过滤,常温组共获得46229373个可用于后续实验的数据,急性冷应激组共获得51684440个可用于后续实验的数据。并且六个样本的错误率均为0.01%;测序后湖羊常温组三个样本文库（H1、H2和H3）共获得45656439个原始数据,急性冷应激组三个样本文库（LH1、LH2和LH3）共获得47987654个原始数据。经过数据过滤,常温组共获得45225921个可用于后续实验的数据,急性冷应激组共获得47571716个可用于后续实验的数据,并且六个样本的错误率均为0.01%。经检测,12个文库样本的mi RNA长度均在20～24nt之间,检测符合试验要求。试验三:1)阿勒泰羊文库中共检测出362个mi RNAs,未知mi RNA有234个,其余为已知mi RNAs。与常温组相比,急性冷应激后发现有25个mi RNAs差异显著表达;湖羊文库中共检测出362个mi RNAs,未知mi RNA有218个,其余为已知mi RNAs。与常温组相比,急性冷应激后发现有24个mi RNAs差异显著表达。经q PCR定量验证结果显示,挑选的mi RNA差异表达结果与高通量测序结果一致,进一步证明了数据的可靠性。2)GO结果显示,阿勒泰羊组共有414个富集于生物学过程,87个富集于细胞组分,337个富集于分子功能;湖羊组共有1237个富集于生物学过程,236个富集于分子功能。KEGG结果发现,阿勒泰羊组中候选靶基因所涉及的主要富集通路有多巴胺能突触（Dopaminergic synapse）、亚油酸代谢（Linoleic acid metabolism）等,与脂肪代谢相关的mi RNA有oar-mi R-3957-5p、oar-mi R-127、oar-mi R-133等;湖羊组中候选靶基因所涉及的主要富集通路有磷脂酰肌醇信号系统（Phosphatidylinositol signaling system）、c GMP-PKG信号通路（c GMP-PKG signaling pathway）等,与脂肪代谢相关的mi RNA有oar-mi R-370-3p、oar-mi R-376c-3p、oar-mi R-26b等。试验四:双荧光素酶检测结果显示,转染oar-mi R-3957-5p和oar-mi R-370-3p可分别显著抑制DRD2-3`-UTR报告基因和SIRT3-3`-UTR报告基因活性。野生型荧光素酶基因活性下降,突变型无显著变化。说明oar-mi R-3957-5p和oar-mi R-370-3p分别与DRD2和SIRT3基因间存在靶向关系。结论:（1）成功构建阿勒泰羊和湖羊急性冷应激后的Small RNA文库,文库质量检测合格,并且丰富了绵羊Small RNA文库。（2）阿勒泰羊和湖羊之间Small RNA文库差异不大。在急性冷应激后的两个文库中mi RNA表达均有显著变化,其中与脂肪代谢相关的差异表达mi RNA较多。由此可见,在急性冷应激后会有大量mi RNA参与脂肪代谢调控作用。（3）证明了oar-mi R-3957-5p和oar-mi R-370-3p分别对DRD2和SIRT3具有靶向调控作用。