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构建合适的基因传递体系,将目的基因稳定传递到病变组织,通过靶向细胞有效内吞后进行高效转染,是基因治疗面临的挑战。目的基因进入靶向细胞面临多重生物膜的壁垒,如细胞间质,细胞膜、溶酶体膜、核膜等,只有有效跨越这些生物膜,才能获得理想的转染效果。构建长效循环的刺激响应性基因传递体系或通过超声介导、光热效应等物理方法促进基因的生物膜跨越是实现基因高效转染的有效手段。本论文采用主客体组装或与超声微泡相结合,构建了多种基因传递体系,促进基因传递体系跨越生物膜以提高基因传递效率。主要开展了以下三部分的研究: 一、环糊精主客体作用在聚肽基因载体的构建和跨膜传递中的研究 利用主客体组装,通过客体分子的选择和优化,可便捷调控和构建多功能的基因纳米粒子。PEG化的基因传递体系具有很好的稳定性和生物相容性,但二次注射易引起人体快速免疫清除。基于此,本论文首先制备了端基偶氮苯修饰的聚肌氨酸-b-聚赖氨酸聚合物(Azo-PSAR-b-PLL,ASL)作为基因载体,凝胶电泳表明:ASL能够很好的包裹浓缩DNA,形成粒径为150nm的粒子。聚肌氨酸作为聚乙二醇的替代物,能够很好的屏蔽聚赖氨酸的正电荷,降低表面电位,显著提高了基因传递体系在生理盐溶液中的稳定性及抗聚阴离子的能力。为了增加基因组装体的穿膜能力,合成了八聚精氨酸修饰的环糊精(CD-R8),通过CD与ASL端基的偶氮苯进行主客体作用,连接具有穿膜作用的八聚精氨酸(R8)。细胞实验结果表明,R8的穿膜效果能有效促进细胞内吞效率,并进一步提高基因转染效率。 二、葫芦[7]脲主客体作用构建光热促进的基因传递体系的研究 葫芦[7]脲(CB[7])具有很好的水溶性和生物相容性,与客体分子的结合常数高达107-1017 M-1。同时CB[7]可与金纳米球(AuNS)结合,为主客体组装和金纳米粒子光热效应的结合提供了基础。本研究首先合成了二硫键键合的甲基紫精修饰聚乙烯亚胺(Mv-S-S-PEI,MPEI)、席夫碱键合的萘修饰聚乙二醇(Np-CH=N-PEG,NPEG)。利用CB[7]与客体分子甲基紫精和萘的主客体作用,将MPEI和NPEG分别连接在CB[7]的一侧。进一步利用CB[7]另一侧与金纳米球的相互作用,制备了MPEI@AuNS@NPEG组装体。凝胶电泳及透射电子显微镜结果表明:MPEI@AuNS@NPEG能有效缔合DNA,形成粒径为200 nm的规整球形粒子,金纳米球均匀的分布在基因超分子组装体中。动态光散射结果表明:PEG壳层能够有效稳定基因组装体,并在肿瘤组织酸性条件下发生响应性脱卸,提高基因内吞效率。更重要的是,激光共聚焦和细胞转染结果表明:在光照条件下,金纳米球的光热效应促进基因组装体逃离溶酶体,使基因更易进入细胞质或细胞核,提高了基因组装体的跨膜传输,并进一步提高了基因转染效率。本研究中主客体作用与光热效应的有效结合,对基因组装体的构建和跨膜传输具有很好的指导意义。 三、超声徼泡促进基因跨膜传递的研究 超声介导基因传递体系能够促进基因载体进入病变组织深处或细胞质内,提高基因载体的生物膜跨越和传递效率,本课题研究并构建了不同的超声介导基因传递体系。首先,利用临床应用的心血管造影剂SonoVue微泡与三种具有不同细胞行为的基因组装体(PEI/DNA,PLL/DNA,PEI-SeSe-PEG/DNA)共混,制备了微泡-基因共混体系。细胞实验结果显示,超声作用下三种基因组装体内吞效率明显降低,但转染效率均有增加;扫描电镜和激光共聚焦实验表明,超声作用能将基因组装体直接运送至细胞质甚至细胞核中,这种内吞方式的改变可能是超声促进基因转染的主要因素。 上述微泡-基因共混体系中,微泡与基因很难同时到达靶向组织,因而超声产生的空化效应不能有效将基因运送至靶向细胞。本研究基于白蛋白(BSA)制备了的阳离子化交联微泡(CPMBs),通过静电作用进一步负载DNA,制备了微泡-基因一体化体系(CPMBs/DNA)。结果显示,CPMBs一体化微泡具有很好的稳定性和负载DNA的能力;细胞实验表明,CPMBs/DNA一体化微泡不仅能够直接将基因运送至细胞质(核)中,还显著提高了细胞的内吞效率,在促进基因转染方面显示出比微泡-基因共混体系更好的提升效果。