血源性病原体,如艾滋病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）等,已严重危害公共卫生安全,特别是在发展中及资源匮乏的国家及地区,输血安全性问题尤其严峻。目前血液病原体筛查技术主要包括血清病原学检测和核酸检测。血清学方法因其检测窗口期长及灵敏度低等限制因素易造成漏检。基于聚合酶链式反应（PCR）的核酸检测虽弥补了血清学检查的不足,极大缩短了检测窗口期,提高了筛查的准确性。然而,PCR技术需要依赖精密的升降温设备,难以在资源匮乏的地区推广使用。因此,开发高灵敏、低成本的血液病原体核酸现场快速筛查技术显得尤为重要。核酸等温扩增检测微流控芯片以其高灵敏、简单、快速、低成本的优势,在病原体现场快速检测中占有一席之地。虽然其低成本性、便携性和易操作性都符合现场即时检测（point-of-care testing,POCT）的要求,但是依赖高精密的微流控泵使其在实际应用时受到了限制;尽管近年来很多纸基微流控芯片摆脱了对泵的依赖,但开放式的反应与检测易产生交叉污染,难以广泛应用。本课题就如何建立高灵敏、低成本、多重血液病原体核酸现场快速检测方法开展研究,在设计并加工了一种自动进样微流控芯片及与其配套的便携式恒温孵育荧光检测装置的基础上,发展了基于逆转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）与重组酶聚合酶扩增核酸外切酶检测技术（RPA-Exo）的等温扩增检测自动进样芯片,并进一步将核酸侵入反应与RPA相偶联,创建了重组酶聚合酶扩增-核酸侵入反应技术（RPA-Invader）,克服了传统RPA技术背景高,反应条件苛刻的问题,实现了在自动进样芯片上快速检测多重血液病原体核酸,为现场快速筛查多重血液病原体提供了新思路。首先,在管内以钙黄绿素作为扩增产物指示剂分别建立了一步逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测血液病原体（HIV、HBV和HCV）核酸的反应体系,并将优化好的反应体系引入到聚二甲基硅氧烷（PDMS）自动进样的微流控芯片中;通过在芯片各反应孔中预载LAMP引物,利用PDMS的透气性,采用真空抽气使芯片内产生负压,实现含有待测模板的反应液自动流入预载不同扩增引物的反应孔中,从而引发RT-LAMP扩增;将芯片置于便携式恒温孵育荧光检测装置中反应并拍照采集各反应孔的荧光信号,从而实现对待测模板的检测。该芯片可实现在63℃下40 min内同时检测低至10拷贝/孔的HIV、HBV和HCV质粒模板,并且特异性良好,无交叉反应产生。但LAMP反应温度较高,时间较长,需要建立反应条件更温和、扩增检测更快速的方法。为此,我们采用Exo核酸外切酶Ⅲ及特异性检测探针来识别扩增产物,建立了基于重组酶聚合酶扩增技术（RPA）的血液病原体（HIV、HBV和HCV）核酸快速检测方法,并将其与自动进样微流控芯片结合;通过改进自动进样微流控芯片的结构布局,设置双反应单元分别预载RPA引物探针和镁离子,满足了RPA反应中镁离子最后加入反应体系的要求,避免了假阳性信号的产生;同样采用自制便携式恒温孵育荧光检测装置,建立了基于RPA-Exo法的血液病原体核酸自动进样微流控检测芯片,实现了在37℃下30 min内检测低至1-10拷贝/孔的HIV、HBV和HCV质粒模板,并且特异性良好。但是由于RPA体系粘稠使得反应孔内信号不均一,不利于后续结果的判读。为了克服芯片上RPA反应信号不均一的问题,将RPA与核酸侵入反应（Invader）相结合,利用核酸侵入反应来特异性识别与报告RPA扩增产物,克服了RPA-Exo法易产生背景信号、镁离子后加操作复杂的问题,从而创建了RPAInvader核酸检测新方法,并与自动进样微流控芯片及检测装置相结合,建立了基于RPA-Invader的多重血液病原体核酸自动进样微流控芯片。该芯片需在37℃下反应30 min后升温至63℃反应10 min,可实现同时检测1-10拷贝/孔的HIV、HBV和HCV质粒模板,特异性良好,且芯片反应的荧光信号均一。本课题的研究结果为建立高灵敏、低成本检测多重血液病原体核酸的现场快速筛查平台提供了新方法,同时也为其他病原体现场即时检测提供了新思路。