作为细胞程序性死亡的主要形式,凋亡是维持机体稳态的重要机制,及时检测凋亡有助于诊治凋亡失调导致的相关疾病。基于膜联蛋白A5/碘化丙啶的流式细胞术凋亡检测方法具有灵敏、高效和特异的优点。细胞凋亡时,磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内侧翻转至外侧,而A5蛋白可与PS钙依赖的高亲和力结合,这是其检测凋亡的原理。从被开发为凋亡探针至今,A5蛋白被广泛用于体外凋亡检测。放射性标记的A5蛋白被开发用于检测体内凋亡或相关疾病。此外,A5蛋白还有许多其他功能与应用:参与细胞膜修复、抗凝血,参与疾病发生发展,体内治疗或介导靶向治疗等。尽管A5蛋白潜在应用丰富,但仍有不少问题亟待解决:1)常用凋亡探针A5-FITC存在制备复杂,产物不均一,光稳定性差等问题;2)流式凋亡检测中关键因素的研究较少,限制了 A5蛋白检测凋亡的进一步优化和标准化;3)应用于体内凋亡检测或治疗时,A5蛋白存在生物分布性差,非特异性,半衰期短等问题,制约了其进一步应用;4)虽然N端被认为是膜联蛋白的主要调节因素,但N端在A5蛋白结构和功能中的调节作用并不明朗。故而,本论文主要从以下几个层面对上述问题进行了研究。首先,成功构建、表达和纯化了 A5-EGFP（A5E）融合蛋白,证实了 A5E蛋白是一个简单、可信、易用并易于制备的凋亡检测探针,优化了基于A5E蛋白的流式细胞术检测凋亡的参数,搭建了凋亡检测平台。利用此探针确定并充分验证了理论推导出的数学模型式。模型式通过简单的数学表达式将影响A5蛋白与凋亡细胞膜结合的两大关键因素-钙离子和蛋白浓度联系在一起。进一步分析表明,凋亡细胞结合的A5蛋白量的倒数分别与钙离子浓度平方的倒数或A5E蛋白浓度的倒数存在线性关系,该线性关系具有普适性,不受凋亡诱导剂、探针标记等的影响。深入分析该式揭示:1)A5蛋白与膜的结合过程高度顺序化,并与钙离子成协同关系;2)不同浓度钙离子诱导产生与膜亲和力不同的A5蛋白构象,与钙离子结合的蛋白随后与膜结合;3)钙离子浓度固定条件下,各A5蛋白分子与膜的结合彼此独立。第二章中,基于文献报道和结构数据,成功构建、表达和纯化了截短A5蛋白N端或C端结构域Ⅳ的变体,并利用流式细胞术、等温滴定量热技术（ITC）和活化部分凝血活酶时间（APTT）等方法对各变体的功能进行评价。结果表明,A5蛋白N端（1-15位氨基酸）对蛋白的凋亡细胞结合能力、钙离子亲和力、PS脂质体亲和力以及抗凝血活性无显著调节作用。当N端截短深入到位于蛋白核心区的16-18位氨基酸时,则导致蛋白凋亡细胞结合能力、PS亲和力和抗凝血活性下降。C端重复结构域Ⅳ对维持蛋白的钙离子结合活性有重要作用,结构域Ⅳ的存在能够保证A5蛋白在膜上结合的最大化。尽管N端不影响A5蛋白的钙离子和PS亲和力,但是分子模拟实验证明N端稳定了二聚体和三聚体A5蛋白的存在,推测N端截短对以A5蛋白聚体为功能单位的生物学过程可能有影响。此外,A5蛋白通常以单体形式存在于溶液中,但当其结合到膜上发挥细胞膜修复、抗凝血等功能时,都以聚体为基本单位。因此构建纯化了 C末端相连的A5蛋白二聚体DA5,以避免N端融合方式影响其对蛋白多聚体的稳定作用。实验表明DA5蛋白具有更高的PS亲和力,可能主要归结于其二聚体形式和动力学优势。体内实验证实PS亲和力的提高,有助于增强蛋白靶向黑色素瘤血管,具有更强的促进肿瘤坏死作用。从体内凋亡显影和治疗用途角度看,蛋白的安全性不可忽视。故利用小鼠对A5、DA5和A53蛋白的急性毒性进行评价,结果表明N端处于自由状态的A5蛋白小鼠致死率达70%,N端处于包裹状态的DA5和截去N端的A53蛋白则没有出现小鼠死亡,最低致死剂量大于700 mg/kg。推测N端相关的细胞内化引起胞内蛋白浓度的提高或其他相关功能,可能与A5蛋白的急性毒性有关。综上,N端的调节作用主要体现在A5蛋白四级结构,N端本身或其介导的A5蛋白在膜上的行为可能与其体内生物学活性或毒性有关。以上研究从细胞和整体动物水平系统研究了膜联蛋白A5的结构与功能关系,为其进一步应用奠定了重要基础。