论文部分内容阅读
目的:研究血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)对原代培养大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar epithelial typeⅡcell,AEC-Ⅱ)生长的直接影响,并探讨HO-1预处理对AEC-Ⅱ在过氧化氢(hygrogen peroxide,H2O2)造成氧化损伤中的作用。方法:免疫粘附法分离纯化SD大鼠AEC-Ⅱ,台盼蓝(trypan blue)拒染法鉴定细胞活性,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)法鉴定细胞纯度,倒置显微镜和电镜观察细胞的形态学和特征性结构。调节AEC-Ⅱ终浓度至1×106个/ml。①观察HO-1对原代培养AEC-Ⅱ生长的影响。细胞随机分为7组:A组(正常对照组);B组(H2O2对照组,0.5mmol/L H2O2);C组(0.01μmol/L HO-1);D组(0.1μmol/L HO-1);E组(1μmol/L HO-1);F组(10μmol/L HO-1);G组(50μmol/L HO-1)。②观察HO-1预处理对原代培养AEC-Ⅱ氧化损伤的影响。细胞随机分为6组:A组(正常对照组);B组(H2O2对照组,0.5mmol/L H2O2),C组(0.01μmol/L HO-1+0.5mmol/L H2O2);D组(0.1μmol/L HO-1+0.5mmol/L H2O2);E组(1μmol/L HO-1+0.5mmol/L H2O2);F组(10μmol/L HO-1+0.5mmol/L H2O2)。细胞分别接种于24孔、96孔培养板中,培养24h加入HO-1,26h加入H2O2。培养至29h进行细胞形态学观察、细胞计数和以四甲基偶氮唑盐酶反应比色法(MTT法)测定细胞光密度值(OD值)。结果:①免疫粘附法纯化建立AEC-Ⅱ原代培养的方法可收获细胞2~2.5×107个/鼠,活性和纯度均>90%;电镜下可见AEC-Ⅱ特征性结构-嗜锇性板层小体(lamellar body,Lb)。②培养AEC-Ⅱ至29h,H2O2对照组与正常对照组比较贴壁细胞数量减少,细胞体积减小,胞内可见反光增强的空泡,大量细胞脱壁,上清液中可见较多的细胞碎片。③0.01~50μmol/L HO-1各处理组与正常对照组比较细胞计数、OD值差异无统计学意义(P>0.05),细胞形态无明显改变;与H2O2对照组比较细胞计数、OD值差异有统计学意义(P<0.05);④0.1~10μmol/L HO-1+0.5mmol/L H2O2组与正常对照组比较细胞计数、OD值差异无统计学意义(P>0.05),细胞形态无明显改变;与H2O2对照组和0.01μmol/L HO-1预处理组比较细胞计数、OD值差异有统计学意义(P<0.05);0.01μmol/L HO-1预处理组与H2O2对照组比较细胞计数、OD值差异无统计学意义(P>0.05)。结论:①免疫粘附法纯化建立AEC-Ⅱ原代培养的方法可收获细胞2~2.5×107个/鼠,纯度和活性均>90%;H2O2造成的氧化损伤模型,细胞形态学改变明显,是一种较好的获得AEC-Ⅱ氧化损伤模型的方法;②0.01~50μmol/L HO-1对原代培养的AEC-Ⅱ没有直接的细胞学毒性;③经0.1~10μmol/L HO-1预处理的AEC-Ⅱ在H2O2氧化损伤环境中仍生长良好,提示此浓度的HO-1对离体原代培养大鼠AEC-Ⅱ氧化损伤起保护作用。