MicroRNA(miRNA)广泛存在于动植物的组织细胞内,扮演着基因转录后信使RNA(mRNA)的调控者的角色。相关研究表明,一些 miRNA的特异性异常表达与癌症有着密不可分的联系。因此,高灵敏度检测 miRNA对于进一步研究 miRNA的调控机制和由miRNA引发的一系列内源性疾病具有非常实际的意义。　　由于miRNA在细胞内的表达量极低,所以通常采用核酸扩增技术将其检测信号放大,进而对其进行定性和定量分析。但是,传统的指数核酸扩增方法,如反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)具有引物设计复杂、检测灵敏度不高以及特异性较差等缺点。连接酶链式反应(LCR)作为另一种指数核酸扩增方法,一般需用聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行分离才能实现核酸的定性和半定量分析,大大延长了检测时间,降低了检测效率。　　本文结合连接酶链式扩增反应和lambda核酸外切酶协助的阳离子共轭聚合物荧光共振能量转移技术,建立了一种高灵敏度均相检测miRNA的新方法。方法设计两对LCR探针,每对探针含有一条3?端荧光标记和5?端磷酸化修饰的探针。首先,以目标miRNA分子为模板,通过T4 RNA连接酶2的特异连接反应产生LCR的连接模板。然后,在热稳定DNA连接酶作用下,进行高效LCR反应,产生大量荧光标记的DNA产物。随后,利用lambda核酸外切酶对双链DNA中5?端磷酸化修饰DNA链的水解作用,使空白溶液和LCR反应中未反应的DNA探针降解为荧光标记的单核苷酸片段。而LCR产物中由于无5?端磷酸化修饰,不会被 lambda核酸酶降解。当加入阳离子共轭聚合物(CCP),其与DNA通过强静电力结合,与DNA上的荧光分子发生高效荧光共振能量转移,并实现荧光信号的二次放大。相比较,荧光标记的单核苷酸片段带电荷少,与CCP静电力作用弱,二者不能发生有效的荧光共振能量转移,基于此,实现了 miRNA的特异、高灵敏度分析。方法均相操作,简便、灵敏度高,可实现0.1 fM目标miRNA分子的高灵敏度检测和特异区分单碱基差别的miRNAs,并成功应用于人肺组织中提取的总RNA中let-7a的检测,方法为基于LCR的均相核酸检测及分子诊断提供了新策略。