藿香正气散干预寒湿困脾型泄泻小鼠的肠道内容物菌群特征研究

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目的:利用16S r RNA基因测序技术研究不同性别小鼠肠道菌群的差异,进一步分析寒湿困脾型泄泻模型及藿香正气散干预对雄性小鼠肠道菌群的影响。方法:Ⅰ.选体质量在16 g-18 g的SPF级昆明小鼠12只(雌雄各半),自由喂养8周后处死,测定血清性激素,无菌收集肠道内容物与肠道黏膜,采用第二代16S r RNA基因测序技术检测肠道菌群并进行结果分析。Ⅱ.选体质量在18 g-20 g的SPF级雄性昆明小鼠10只分为正常组和模型组,适应性饲养3 d后进行寒湿困脾型泄泻造模,造模成功后无菌收集小鼠肠道内容物,采用第三代16Sr RNA基因测序技术检测肠道菌群并进行分析。Ⅲ.选体质量在18 g-20 g的SPF级雄性昆明小鼠15只,其中正常组5只,模型组10只。造模成功后,随机分为自愈组与中药治疗组,中药治疗组按5.67 g/(kg·d)的临床等效剂量进行灌胃,2次/d,治疗3 d。其余小鼠灌胃等量蒸馏水。实验结束后无菌收集肠道内容物,采用第三代16S r RNA基因测序技术检测肠道菌群并进行结果分析。结果:Ⅰ.性别实验表明,雌性小鼠肠道拟杆菌门相对丰度高于雄性(P<0.05);Muribaculaceae、链球菌属、普雷沃氏菌属、Enterorhabdus、Parasutterella在雌性富集并显著高于雄性(P<0.05),双歧杆菌属、拟杆菌属、Gammaproteobacteria、嗜血杆菌属在雄性富集并显著高于雌性(P<0.05)。肠黏膜样本中,Parasutterella、Muribaculaceae与雌二醇呈强正相关性(P<0.01),双歧杆菌、短状杆菌属、拟杆菌属等7种细菌与睾酮具有正相关关系(P<0.05)。肠内容物样本中,粪杆菌属、苏黎世杆菌属、Muribaculaceae与雌二醇呈极强正相关性(P<0.01),与睾酮则恰恰相反(P<0.05);肠黏膜菌群的唯一差异性代谢通路为糖鞘脂生物合成globo与isoglobo系列(P<0.05)。Ⅱ.菌群多样性分析结果显示,寒湿困脾型泄泻模型显著性提高了Chao 1指数(P<0.05),β多样性分析提示两组间存在一定的群落结构差异。物种组成分析表明,Epsilonbacteraeota是模型组的特有菌门;Clostridium sensu stricto 1与堀越氏芽孢杆菌分别为模型组独有优势菌属与菌种。此外,模型组出现了螺旋杆菌、罗氏菌属、假单胞菌等30余种稀有细菌,大部分为机会致病菌或致病菌。LEf Se分析显示Eubacterium plexicaudatum ASF492、毛螺菌科、罗氏菌属等是模型组差异性物种。Ⅲ.藿香正气散治疗后,中药治疗组肠道菌群OTUs数进一步增加。物种组成分析表明,Deferribacteres是自愈组特有菌门,Clostridium sensu stricto 1与Clostridium sp.ND2分别为自愈组特有优势菌属与菌种,治疗组降低了造模出现的Modestobacter sp.Leaf380、产酸拟杆菌等13个菌种丰度,恢复了造模导致减少的部分菌种丰度,如Bifidobacterium pseudolongum PV8-2、耐辐射甲基杆菌。LEf Se分析显示梭菌科1与Oryza sativa Japonica Group(Japanese rice)科为自愈组差异性物种。结论:昆明种小鼠肠道菌群具有性别差异,并可能是导致疾病性别二态性的生理病理基础之一,这提示我们动物实验时要考虑性别是否对实验具有干扰。寒湿困脾型泄泻的肠道内容物菌群特征为机会致病菌与大量稀有细菌的滋长,细菌资源利用能力的降低,影响寒湿困脾型泄泻发生的关键细菌可能是Clostridium sensu stricto 1。藿香正气散治疗寒湿困脾型泄泻的肠道内容物菌群特征为提高了细菌的多样性与资源利用率、抑制大量稀有细菌的生长及恢复小鼠肠道内容物丰富菌群丰度,其中Clostridium sensu stricto 1很有可能成为藿香正气散治疗寒湿困脾型泄泻的主要靶向菌。
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