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目的:
研究GTPBP4在结肠癌组织中的表达及其与结肠癌临床病理特征、预后的相关性。利用慢病毒LV-GTPBP4-RNAi转染人结肠癌RKO细胞，敲减GTPBP4基因，探讨GTPBP4RNAi对RKO细胞增殖、凋亡等生物学行为的影响。探讨GTPBP4在结肠癌发生发展中的作用。
1.临床结肠癌患者组织样本GTPBP4表达与临床病理特征、预后的关系
1.1 方法:
(1)经病理诊断证实的西南医科大学附属医院结肠癌病例90例，同时收集患者一般个人资料、临床病理资料。
(2)将肿瘤组织及相应癌旁组织制作组织芯片，免疫组织化学方法检测结肠癌组织及癌旁组织中GTPBP4的表达。
(3)统计分析:采用SPSS软件进行统计学分析，计数资料的比较采用x2检验，计量资料比较采用t检验。应用Kapla-Meier法进行生存分析，Log-Rank进行检验;影响因素分析采用COX回归模型分析，计算出OR值及95％可信区间，P＜0.05为差异有统计学意义。
1.2 结果:
(1)癌组织中GTPBP4的免疫组化染色评分为11.85±4.14，癌旁组织中GTPBP4的染色评分为9.67±3.25，GTPBP4在癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织，差异具有统计学意义(t=3.738，p=0.000)。
(2)GTPBP4蛋白在不同患者性别、年龄、肿瘤生长部位、肿瘤大小、T分期和N分期中的表达无显著差异（均P＞0.05）。
(3)GTPBP4蛋白高表达55例(55/90，61.11％)，低表达35例(35/90，38.89％)。生存分析显示GTPBP4表达水平与患者总生存期无相关性，(Log-Rank p=0.103)。
(4)COX回归模型分析结果显示GTPBP4不是影响结肠癌预后的独立因素(OR=0.617,95％CI=0.325-1.171,P=0.140)。
1.3 结论:
(1)结肠癌组织中GTPBP4蛋白表达水平显著高于癌旁组织。
(2)GTPBP4蛋白表达与临床病理特征之间无相关性。
(3)GTPBP4蛋白的表达水平与总体生存期无关。
(4)GTPBP4不是结肠癌患者预后的独立影响因素。
2.GTPBP4RNAi对RKO细胞增殖、凋亡等生物学行为的影响
2.1 方法:
(1)慢病毒感染RKO细胞5天后，根据Invitrogen公司的Trizol试剂盒使用说明提取实验组和对照组RKO细胞总RNA，使用Promega公司的M-MLV试剂盒逆转录获得cDNA，Real-Time PCR(RT-PCR)检测RKO细胞中GTPBP4基因mRNA表达水平。
(2)慢病毒感染RKO细胞5天后，分别提取实验组和阴性对照组总蛋白，采用Western Blot检测GTPBP4表达量。经灌胶、上样、电泳、转膜、免疫反应、化学发光、显影、定影，根据蛋白条带分析基因敲减效率。
(3)Cellomics细胞计数检测敲减GTPBP4基因后，RKO细胞在体外生长状况的改变。
(4)MTT法检测GTPBP4基因敲减后，RKO细胞的增殖能力变化。
(5)AnnexinⅤ-PAC单染法流式细胞检测GTPBP4基因敲减后，实验组与阴性对照组细胞凋亡率的差别。
(6)PI-FACS法检测敲减GTPBP4基因后，结肠癌RKO细胞增殖周期分布的变化。
(7)平板克隆形成实验检测GTPBP4基因敲减后，RKO细胞在细胞培养板上的克隆形成能力，以此判断慢病毒感染后细胞的成瘤能力。
(8)统计分析:采用SPSS软件进行统计学分析，计数资料的比较采用x2检验，计量资料比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.2 结果:
(1)RT-PCR检测结果显示，对照组GTPBP4mRNA△Ct值为5.95±0.12，实验组为8.21±0.05。实验组GTPBP4mRNA与对照组相比有显著下降(P=0.002)。
(2)Western Blot灰度结果分析显示，转染病毒后，较对照组，实验组RKO细胞中GTPBP4蛋白表达量显著降低。GTPBP4基因敲减后，其蛋白敲减效率达到72.9％。
(3)Cellomics细胞计数检测细胞生长:经siRNA慢病毒感染后，增殖倍数均值和细胞计数均值显示实验组RKO细胞的增殖速率受到抑制，其中增殖倍数受到抑制明显(p=0.042)。
(4)MTT增殖检测:siRNA慢病毒感染后，实验组RKO细胞MTT值比值（即增殖倍数）减小，但差异不显著(p=0.126)。
(5)AnnexinⅤ-APC单染法流式细胞仪检测细胞凋亡:经siRNA慢病毒感染后，实验组与对照组RKO细胞凋亡峰值无明显差异(p=0.923)，但实验组凋亡峰值出现时间早于对照组。
(6)PI-FACS细胞周期检测:经siRNA慢病毒感染后，实验组细胞停滞于G1(p＜0.05)、G2/M期，处于S期细胞明显减少(p＜0.05)，提示GTPBP4基因参与RKO细胞增殖周期调控。
(7)细胞克隆形成实验:siRNA慢病毒感染后，与对照组相比，实验组RKO细胞集落数目减少，提示GTPBP4基因与RKO细胞的克隆形成能力相关。
2.3 结论:
(1)siRNA慢病毒能够感染人结肠癌RKO细胞，并且能够成功敲减GTPBP4基因表达。
(2)RKO细胞株GTPBP4基因表达抑制后，细胞的增殖速率也受到显著抑制;细胞处于G1期显著增多，S期明显减少;实验组RKO细胞增殖倍数减小，凋亡峰值出现时间早于对照组;实验组RKO细胞集落数目减少。
(3)GTPBP4可能通过促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡而影响结肠癌的发生发展。
研究GTPBP4在结肠癌组织中的表达及其与结肠癌临床病理特征、预后的相关性。利用慢病毒LV-GTPBP4-RNAi转染人结肠癌RKO细胞，敲减GTPBP4基因，探讨GTPBP4RNAi对RKO细胞增殖、凋亡等生物学行为的影响。探讨GTPBP4在结肠癌发生发展中的作用。
1.临床结肠癌患者组织样本GTPBP4表达与临床病理特征、预后的关系
1.1 方法:
(1)经病理诊断证实的西南医科大学附属医院结肠癌病例90例，同时收集患者一般个人资料、临床病理资料。
(2)将肿瘤组织及相应癌旁组织制作组织芯片，免疫组织化学方法检测结肠癌组织及癌旁组织中GTPBP4的表达。
(3)统计分析:采用SPSS软件进行统计学分析，计数资料的比较采用x2检验，计量资料比较采用t检验。应用Kapla-Meier法进行生存分析，Log-Rank进行检验;影响因素分析采用COX回归模型分析，计算出OR值及95％可信区间，P＜0.05为差异有统计学意义。
1.2 结果:
(1)癌组织中GTPBP4的免疫组化染色评分为11.85±4.14，癌旁组织中GTPBP4的染色评分为9.67±3.25，GTPBP4在癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织，差异具有统计学意义(t=3.738，p=0.000)。
(2)GTPBP4蛋白在不同患者性别、年龄、肿瘤生长部位、肿瘤大小、T分期和N分期中的表达无显著差异（均P＞0.05）。
(3)GTPBP4蛋白高表达55例(55/90，61.11％)，低表达35例(35/90，38.89％)。生存分析显示GTPBP4表达水平与患者总生存期无相关性，(Log-Rank p=0.103)。
(4)COX回归模型分析结果显示GTPBP4不是影响结肠癌预后的独立因素(OR=0.617,95％CI=0.325-1.171,P=0.140)。
1.3 结论:
(1)结肠癌组织中GTPBP4蛋白表达水平显著高于癌旁组织。
(2)GTPBP4蛋白表达与临床病理特征之间无相关性。
(3)GTPBP4蛋白的表达水平与总体生存期无关。
(4)GTPBP4不是结肠癌患者预后的独立影响因素。
2.GTPBP4RNAi对RKO细胞增殖、凋亡等生物学行为的影响
2.1 方法:
(1)慢病毒感染RKO细胞5天后，根据Invitrogen公司的Trizol试剂盒使用说明提取实验组和对照组RKO细胞总RNA，使用Promega公司的M-MLV试剂盒逆转录获得cDNA，Real-Time PCR(RT-PCR)检测RKO细胞中GTPBP4基因mRNA表达水平。
(2)慢病毒感染RKO细胞5天后，分别提取实验组和阴性对照组总蛋白，采用Western Blot检测GTPBP4表达量。经灌胶、上样、电泳、转膜、免疫反应、化学发光、显影、定影，根据蛋白条带分析基因敲减效率。
(3)Cellomics细胞计数检测敲减GTPBP4基因后，RKO细胞在体外生长状况的改变。
(4)MTT法检测GTPBP4基因敲减后，RKO细胞的增殖能力变化。
(5)AnnexinⅤ-PAC单染法流式细胞检测GTPBP4基因敲减后，实验组与阴性对照组细胞凋亡率的差别。
(6)PI-FACS法检测敲减GTPBP4基因后，结肠癌RKO细胞增殖周期分布的变化。
(7)平板克隆形成实验检测GTPBP4基因敲减后，RKO细胞在细胞培养板上的克隆形成能力，以此判断慢病毒感染后细胞的成瘤能力。
(8)统计分析:采用SPSS软件进行统计学分析，计数资料的比较采用x2检验，计量资料比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.2 结果:
(1)RT-PCR检测结果显示，对照组GTPBP4mRNA△Ct值为5.95±0.12，实验组为8.21±0.05。实验组GTPBP4mRNA与对照组相比有显著下降(P=0.002)。
(2)Western Blot灰度结果分析显示，转染病毒后，较对照组，实验组RKO细胞中GTPBP4蛋白表达量显著降低。GTPBP4基因敲减后，其蛋白敲减效率达到72.9％。
(3)Cellomics细胞计数检测细胞生长:经siRNA慢病毒感染后，增殖倍数均值和细胞计数均值显示实验组RKO细胞的增殖速率受到抑制，其中增殖倍数受到抑制明显(p=0.042)。
(4)MTT增殖检测:siRNA慢病毒感染后，实验组RKO细胞MTT值比值（即增殖倍数）减小，但差异不显著(p=0.126)。
(5)AnnexinⅤ-APC单染法流式细胞仪检测细胞凋亡:经siRNA慢病毒感染后，实验组与对照组RKO细胞凋亡峰值无明显差异(p=0.923)，但实验组凋亡峰值出现时间早于对照组。
(6)PI-FACS细胞周期检测:经siRNA慢病毒感染后，实验组细胞停滞于G1(p＜0.05)、G2/M期，处于S期细胞明显减少(p＜0.05)，提示GTPBP4基因参与RKO细胞增殖周期调控。
(7)细胞克隆形成实验:siRNA慢病毒感染后，与对照组相比，实验组RKO细胞集落数目减少，提示GTPBP4基因与RKO细胞的克隆形成能力相关。
2.3 结论:
(1)siRNA慢病毒能够感染人结肠癌RKO细胞，并且能够成功敲减GTPBP4基因表达。
(2)RKO细胞株GTPBP4基因表达抑制后，细胞的增殖速率也受到显著抑制;细胞处于G1期显著增多，S期明显减少;实验组RKO细胞增殖倍数减小，凋亡峰值出现时间早于对照组;实验组RKO细胞集落数目减少。
(3)GTPBP4可能通过促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡而影响结肠癌的发生发展。