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牛结核病(Bovine tuberculosis)是一种主要由牛型分枝杆菌(M.bovis)感染引起的危害严重的人畜共患病。结核病牛可通过鼻腔或泌乳等方式向外排菌,呼吸道飞沫传播是牛分枝杆菌的主要传播方式。世界动物卫生组织(OIE)推荐的巢式PCR方法可以有效检测牛鼻拭子中分枝杆菌DNA,有研究报道基于此方法发现超过15%的结核病牛向外排菌。为了筛选牛结核病特别是不同感染状态牛结核病的诊断用分子标志物,本研究采用皮内变态反应(TST)和IFN-γ释放试验(IGRA)在临床上筛选结核病阳性牛(bTB,n=40)和健康牛(NC,n=20),并采用OIE推荐的巢式PCR方法将结核病阳性牛分为PCR阳性结核病牛(bTB PCR-P,n=20)和PCR阴性结核病牛(bTB PCR-N,n=20)。以牛型提纯结核菌素PPD-B刺激牛外周血淋巴细胞(PBMCs)6 h,并设PBS刺激组为对照。采用RNA-Seq技术对PBMCs总RNA进行高通量测序,描绘不同感染状态结核病牛的转录表达谱。结果显示在PPD-B刺激和非刺激条件下,不同感染状态结核病牛PBMCs的mRNA表达谱显著不同,组间鉴定到数目可观的差异表达基因,差异表达基因功能和所涉及的信号通路揭示了结核病牛在不同感染状态下特有的生理特征。本研究基于转录组学结果,筛选了12个有潜力的牛结核病分子标志物。以临床筛选的51头牛为独立样本,扩群验证了分子标志物的诊断能力。qRT-PCR结果表明PPD-B刺激条件下IL-8,和LTA在结核病阳性牛(包括PCR阳性和PCR阴性结核病牛)中的mRNA表达水平显著高于健康牛,受试者特征曲线(ROC曲线)显示IL-8(AUC=0.9991)和LTA(AUC=0.9343)具有较高的诊断应用价值;PPD-B刺激条件下BCL2(AUC=0.9100),CRP(AUC=0.9619)和CHI3L1(AUC=0.8893)可以将临床上PCR阳性和PCR阴性的结核病牛进行有效区分。由于商品化的牛ELISA试剂盒的限制,我们评价了分子标志物IL-8和CRP在结核病牛血浆中的蛋白含量并确定了诊断用cutoff值。双盲试验以244头牛为实验动物,分别用TST,IGRA,nest-PCR和PPD-B刺激的IL-8与CRP ELISA进行检测,结果表明PPD-B刺激下血浆IL-8与TST(κ=0.877)和IGRA(κ=0.926)均具有很高的吻合度,可以用于区分结核病牛与健康牛;PPD-B刺激下血浆CRP与nest-PCR(κ=0.9117)有较高吻合度,可以区分临床上PCR阳性和PCR阴性的结核病牛。本研究成功构建了牛分枝杆菌BALB/c小鼠感染模型。以牛分枝杆菌AN5静脉注射小鼠,同时设对照组。连续观察56天,不论是脏器系数,组织病理学观察还是脏器载菌量均表明感染模型建模成功。利用qRT-PCR和ELISA在mRNA和蛋白水平验证了牛结核病分子标志物在小鼠模型上不同感染时间的表达情况。结果证实,LTA,CRP,BCL2等分子标志物在小鼠感染模型与牛上的表达水平基本一致,该结果进一步提高了分子标志物的可靠性。综上所述,本研究首次描绘了不同感染状态结核病牛PBMCs的转录表达谱,阐明了不同感染状态结核病牛生理状态的异质性,证实了PCR阳性与PCR阴性结核病牛不同的免疫应答反应。同时筛选并验证了IL-8、LTA、CRP、BCL2和CHI3L1是具有诊断价值的牛结核病分子标志物。本研究提供了新的视角来认识牛结核病发病进程,为牛结核病不同感染状态的区分提供了理论支持,新型分子标志物的成功筛选和验证为牛结核病的临床诊断提供了客观依据。