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第一部分BCL-6介导弥漫性大B细胞淋巴瘤对西达本胺耐药的机制研究目的:探究弥漫性大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）对组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylase,HDAC）抑制剂西达本胺耐药性的机制并探究克服其耐药的方法。方法:通过高通量转录组测序筛选出西达本胺（Chidamide）处理后的差异蛋白编码基因。GO（Gene Ontology Resource）,KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）以及 GSEA（Gene Set Enrichment Analysis）数据库用于差异基因富集分析,以评价西达本胺调控的信号通路以及生物学过程。结合CCLE（Cancer Cell Line Encyclopedia）数据库中肿瘤细胞系基因表达数据集以及GDSC（Genomics of Drug Sensitivity in Cancer）数据库中肿瘤细胞系对 4 种HDAC抑制剂耐药性数据集,通过相关性分析筛选HDAC抑制剂耐药相关蛋白编码基因。随后对比西达本胺处理后差异基因,确定在DLBCL细胞中介导了西达本胺耐药的基因。分别检测三株DLBCL细胞中西达本胺的IC50以及BCL-6蛋白表达水平,确定BCL-6与西达本胺敏感性之间的关系。转染siRNA下调BCL-6的表达,检测对DLBCL细胞生物学表型的影响。通过CRISPR-Cas9在耐药的FARAGE细胞中敲除BCL-6,检测西达本胺IC50变化。使用SU-DHL-8以及SU-DHL-2细胞构建西达本胺耐药细胞系,检测BCL-6蛋白表达量的变化。检测BCL-6蛋白表达量对西达本胺上调组蛋白乙酰化水平能力的影响。运用免疫共沉淀以及western blot实验检测BCL-6对HDAC1结合组蛋白H3能力的影响。检测地西他滨（Decitabine）,来那度胺（Lenalidomide）以及伊布替尼（Ibrutinib）对DLBCL细胞的杀伤能力,并分别检测与西达本胺的协同效果。检测来那度胺对BCL-6蛋白表达量的影响,并通过MG-132以及免疫共沉淀技术检测来那度胺靶向降解BCL-6蛋白的机制。体内实验构建小鼠DLBCL皮下肿瘤模型,验证西达本胺与来那度胺联合治疗DLBCL肿瘤的效果。结果:西达本胺对DLBCL细胞整体转录水平有显著影响,大部分差异基因表达量上调。差异基因富集分析结果显示,西达本胺能够调控包括细胞周期、能量代谢、蛋白翻译及转运在内的诸多生物学途径,并且对多个癌症发生发展相关通路均有影响。相关性分析共筛选出5个HDAC抑制剂耐药相关基因。通过对比测序结果,确定了介导西达本胺耐药的靶蛋白BCL-6进行后续研究。西达本胺在三株DLBCL细胞系中的IC50具有显著差异,并且高表达BCL-6细胞系中西达本胺IC50较高。下调BCL-6表达,在高表达BCL-6的FARAGE细胞株中抑制了细胞增殖,诱导细胞周期阻滞以及促进细胞凋亡,而在其他细胞中没有作用。在FA-RAGE细胞中敲除BCL-6基因,西达本胺IC50随之降低,且使用SU-DHL-2构建的耐药细胞株中BCL-6蛋白表达量增高。高BCL-6蛋白水平能够抑制西达本胺上调组蛋白乙酰化水平的能力。在FARAGE细胞中干扰BCL-6的表达,HDAC1结合组蛋白H3的能力下降。地西他滨,来那度胺以及伊布替尼三种药物对DLBCL细胞的杀伤能力并不明显,但在DLBCL细胞中均与西达本胺具有不同程度的协同作用,其中来那度胺与西达本胺协同效果最佳。来那度胺处理FARAGE细胞能够显著降低BCL-6蛋白含量,而不影响其mRNA水平。免疫共沉淀实验证明来那度胺通过泛素化途径降解BCL-6,且MG-132能够恢复这一现象。体内实验中,西达本胺联合来那度胺有效抑制了DLBCL肿瘤生长,并且相对于单独使用西达本胺更具优势。结论:西达本胺能够调控众多肿瘤相关通路,促进BCL-6转录。BCL-6通过招募HDAC1促进其与组蛋白H3的结合,变相提高HDACs酶活,从而使DLBCL细胞对西达本胺耐受。来那度胺通过泛素化途径靶向降解BCL-6蛋白,克服DLBCL细胞对西达本胺的耐药。第二部分DLBCL细胞外囊泡源CD47抑制巨噬细胞免疫功能的机制研究目的:本研究目的在于发现新的弥漫性细胞淋巴瘤抑制巨噬细胞免疫功能的机制,并通过寻找消除免疫抑制的方法,为临床治疗DLBCL提供新的方向。方法:利用单因素以及多因素生存分析评价CD47在DLBCL病人预后评估中的作用。建立NCCN-IPI预后模型和NCCN-IPI+CD47预后模型,比较二者预后效能。免疫荧光实验检测DLBCL肿瘤组织中Ml以及M2亚型巨噬细胞浸润情况。使用纳米金免疫电镜,流式细胞术以及western blot检测DLBCL细胞来源的胞外囊泡（Extracellular vesicle,EV）中CD47表达情况。体外诱导分化M1以及M2亚型巨噬细胞,并通过免疫荧光实验检测DLBCL细胞来源胞外囊泡与巨噬细胞之间的结合能力。通过CRISPR-Cas9敲除CD47,探究胞外囊泡结合巨噬细胞能力的变化。通过体外吞噬实验检测DLBCL细胞来源胞外囊泡对M1亚型巨噬细胞吞噬能力的影响。比较DLBCL病人与健康人外周血血浆CD47水平的差异。结合高通量转录组测序,分析西达本胺对于巨噬细胞极化的影响。结果:生存分析结果显示,CD47能够作为DLBCL病人的独立预后因子,并且可以改善NCCN-IPI预后模型的准确性。M1以及M2亚型巨噬细胞在DLBCL肿瘤组织中均存在。DLBCL细胞来源胞外囊泡表面存在CD47,且胞外囊泡中CD47含量与DLBCL细胞一致。高CD47水平胞外囊泡与巨噬细胞结合能力更强。敲除CD47的表达能够抑制胞外囊泡与巨噬细胞的结合能力。胞外囊泡抑制M1亚型巨噬细胞吞噬作用,且CD47表达量越高抑制作用越强。相比于健康人,DLBCL患者外周血血浆CD47含量上调,且主要分布于外周血游离胞外囊泡表面。西达本胺能够促使M2亚型巨噬细胞向抑癌的M1亚型方向靠拢。结论:本研究发现CD47能够作为DLBCL病人独立预后因子,并改善NCCN-IPI预后模型效能。DLBCL细胞来源胞外囊泡同样表达CD47,并通过结合巨噬细胞抑制其吞噬功能。西达本胺能够部分回复巨噬细胞M2亚型极化。