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札幌病毒(Sapovirus,SV)属于杯状病毒科,是急性胃肠炎的主要病原体之一。本研究选取根据札幌病毒的基因结构保守区设计多对引物和探针对札幌病毒进行了普通RT-PCT和实时荧光RT-PCR检测,筛选出了特异性强、灵敏度高的引物和探针。对于普通RT-PCR而言,引物SLV5317/SLV5749较理想:对于实时荧光RT-PCR而言,引物SaV124F/SaV1F/SaV5F/SaV1245R和探针SaV124TP/SaV5TP较理想。
在此基础上建立了贝类产品中札幌病毒的RNA提取方法,然后进行普通RT-PCR和实时荧光RT-PCR方法检测。该方法先使用PEG对贝类中的札幌病毒进行富集,使用Tri-reagent提取材料中的总RNA,针对札幌病毒RNA 3端含多聚A尾的特点,用带有多聚dT的磁珠对病毒RNA进行纯化,获得纯度较高的RNA。
为了进一步提高检验效率,本研究进行了在一管中同时检测札幌病毒和诺沃克病毒(Norovirus,NV)的复合实时荧光RT-PCR检测的初步研究,利用两个荧光通道,同时在贝类样品中检测两种病毒,灵敏度达到102拷贝,可以运用于人类杯状病毒的初筛。