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茶树(Camelliasinensis(L.)O.Ktze)是一种具有多种利用价值的经济作物,中国拥有丰富的茶树资源和大面积的茶叶产区。茶园草害是导致茶叶产量与品质的下降的主要原因之一。目前茶园除草的方式主要包括人工除草、化学除草、物理性除草以及生态控草等。由于欧盟组织提高了茶叶的农残标准,化学除草剂在茶园的使用受到限制。所以,研发新的安全、环保、高效的生物除草剂用于茶园除草势在必行。本研究致力于筛选出致病力强、对茶树等经济作物安全的优势植物病原菌,评估该菌株的除草潜力,为生物除草剂的研发提供候选菌株。我们调查了江、浙、皖三省共16个茶园杂草发生的种类,采集危害严重的杂草患病样本114份,从中分离出214株真菌分离物,筛选出44株植物病原菌。其中可在寄主叶片上形成严重病斑(病斑直径大于10 mm)的优势菌株有11株,观察菌株形态和分析DNA序列,确定这11株优势菌株分别为平脐蠕孢属的双色平脐蠕孢[Bipolaris bicolor(Mitra)Shoem]和狗尾草平脐蠕孢[Bipolaris setariae(Sawada)Shoemaker],链格孢属的链格孢霉[Alternaria alternate(Fr.)keissle],弯孢属的间型弯孢(Curvularia intermedia Boedijin)(2 株)、新月弯孢[Curvularia lunata(Wakker)Boedijin],镰刀属的层出镰刀菌[Fusariumproliferatum(Matsush.)Nirenberg ex Gerlach&Nirenberg]和木贼镰刀菌[Fusarium equiseti(Corda)Sacc](2株),棒孢属的多主棒孢[Corynespora cassiicola(Berk.M.A.Curtis)C.T.Wei]和茎点霉属的荸荠点霉[Didymella bellidis(Neerg.)Q.Chen&L.Cai],共6属9种的病原真菌。查阅文献了解优势菌株的背景,筛除已有应用于生物除草剂研究的或造成经济作物严重危害的菌株。11株优势菌株中仅有双色平脐蠕孢菌SYNJC-2-2符合上述条件。随后在实验条件下测试双色平脐蠕孢菌株SYNJC-2-2对牛筋草[Eleusine indica(L.)Gaertn]离体叶片及幼苗的致病力,结果显示当菌株孢子悬浮液的浓度大于5×104个/mL时,对牛筋草的防除效果可达95%以上。因此,确定双色平脐蠕孢菌株SYNJC-2-2为候选菌株。测试双色平脐蠕孢菌SYNJC-2-2对8科17种常见作物的致病性,结果发现该菌株对茶、烟草(Nicotiana tabacum L.)、油菜(Brassicanapus L)、花生(Arachis hypogaea Linn)、水稻(Oryza sativa L)、小麦(Triticum aestivum L)、芝麻(Sesamum indicum L)、菠菜(Spinaciaoleracea L)、板蓝根(Isatistinctoria L)和金银花(Lonicerajaponica Thunb)等作物具有高度安全性,高浓度孢子悬浮液处理下可引起玉米和大豆的叶片感病。在测试的18科42种杂草中,双色平脐蠕孢菌对禾本科的牛筋草、葇枝莠竹(Microstegiumvimineum(Trin.)A.Camus)、狗尾草(Setaria viridis(L.)Beauv.)、狼尾草(Pennisetum alopecuroides(L.)Spreng.)、马唐(Digitariasanguinalis(L.)Scop)、光头稗(Echinochloa colonum(L.)Link)、披碱草(Elymus dahuricus Turcz)、荩草(Arthraxon hispidus(Thunb.)Makino)、黑麦草(LoliumperenneL)等均具有致病性。当孢子悬浮液浓度大于104个/mL时,菌株对牛筋草、葇枝莠竹和狗尾草的防除效果超过90%。营养源、温度、pH值等因素对双色平脐蠕孢菌SYNJC-2-2的菌丝生长均有不同程度的影响。在PSA培养基中菌丝生长状态最好,最佳温度范围在25~30℃,最易被其利用的碳源物质是蔗糖,氮源物质是甘氨酸和天冬酰胺。在偏碱性(pH=8)或12 h/12 h光暗交替的光照条件下更适宜菌株的菌丝生长。菌株在牛筋草汁液培养基中可大量产孢,在偏酸性条件下(pH=5)更易产孢,当温度为30℃时产孢量最大,最适碳氮源分别为乳糖和赖氨酸,紫外灯或黑光灯照射处理可显著促进其产孢。孢子萌发需在相对湿度大于90%的高保湿环境中。以PSA培养基为营养源时,孢子萌发率最高。培养温度为25℃或pH值等于7的条件下,最适宜孢子的萌发。当以蔗糖、乳糖或甘露醇为碳源,赖氨酸、氯化铵或硫酸铵为氮源时,孢子更易萌发。在51℃下处理10 min后,孢子失去活性。利用化学染色法、光学显微镜观察以及扫描电镜观察双色平脐蠕孢菌株侵染过程。结果发现该菌株侵染速度快,菌块接种12h时,牛筋草叶片表面出现可见病斑,24h时叶片细胞大量死亡。孢子接种牛筋草叶片3h后两极有芽管生成,6h菌丝末梢膨大形成附着胞,12h叶片表皮破损。菌株主要通过形成附着胞从叶片细胞间隙侵入,也可从细胞气孔侵入。以上结果表明双色平脐蠕孢侵染目标杂草速度快、致病力强、对茶树安全性高、在适合的条件下能够大量产孢,环境适应性强,易于通过人工培养繁殖,具有开发为生物除草剂用于防控茶园杂草的潜力。同时,该菌株对油菜、棉花、芝麻等多种农田作物以及金银花、板蓝根等中药材均具有高度安全性,适用范围广,但是将其开发为生物除草剂并且产业化,还需深入研究其扩大生产的工艺、剂型的配制以及作用机理等。