随着绿色荧光蛋白的突变体和光学显微镜荧光成像技术的快速发展，荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)广泛应用于活细胞中分子内或分子间相互作用的分析。例如，对感兴趣的蛋白用供体和受体荧光团进行标记，蛋白与蛋白之间相互作用的程度就能够通过测量供受体荧光团之间能量转移的效率来定量。目前常使用的定量测量FRET效率值(E)的方法有荧光寿命(Fluorescencelifetime，FLIM)法、基于受体敏华发射的方法以及完全的受体光漂白法。然而，这些方法也呈现出了一些限制。　　 2010年我们组发展了一种部分受体光漂白的定量FRET方法，叫做PbFRET方法，它消除了受体的激发串扰和供体的发射光谱串扰。PbFRET方法不需要任何额外的参考样品只需在供体激发光激发下同时探测部分受体光漂白前后双通道（供体通道和受体通道）上的荧光强度即可在单个活细胞中直接定量FRET效率。这种方法不受漂白程度和漂白期间及漂白后图像采集期间荧光团扩散的影响。因此，PbFRET方法能够通过漂白一小部分的受体来实现，联合激光扫描共聚焦显微镜的ROI(region of interest)或点漂白功能，它甚至可以通过只漂白活细胞的极小区域来实现，这就极大地降低了对活细胞的损伤。PbFRET方法能够在秒量级甚至微秒量级的时间尺度内完成，使得它适用于单个活细胞中FRET效率动态变化的实时监测。　　 然而，PbFRET方法有一个严格的限制条件:供体通道必须选择性地收集供体的荧光，这也是上面提到的FLIM法和完全受体光漂白法的要求。这个限制要求供受体的发射光谱要有足够的分离，这在目前广泛使用的系统条件下就限制了一些荧光蛋白在FRET技术中的使用。例如，GFP作为所有荧光蛋白的母体，相比它的其它变异体不仅性质稳定，而且亮度和YFP差不多。另外，相比CFP-YFP对，同样供受体的距离间隔上GFP-YFP FRET对有更高的FRET效率。这些优点使得GFP-YFP对能够灵敏地反映更远距离上的相互作用并且获取更高的信噪比。这样看起来似乎GFP-YFP对应该是用于活细胞中FRET定量研究的最常使用的供受体对。然而，事实上却是CFP-YFP对。唯一的原因就在于GFP-YFP对中供体和受体的发射光谱离得太近而不能分开，尤其受体的发射光谱对供体通道有着极大的串扰，使得FLIM和目前流行的所有基于荧光强度的方法都不适用于GFP-YFP对的定量化。　　 本论文在PbFRET方法的基础上进一步消除了受体的发射光谱串扰，解除了供体通道选择性地收集供体荧光这个限制条件，得到了完全克服光谱串扰的B-PbFRET方法。B-PbFRET方法在一定程度允许我们更自由地选择供体通道，促使更多的荧光蛋白或染料适用于FRET技术的应用中。此外，基于B-PbFRET的理论分析，本论文也针对给定的供受体对发展了一种更为直接的矫正方法，叫做C-PbFRET方法，它能够在有受体发射串扰的情况下从PbFRET方法的测量值上得到效率E。最后，我们在单个活细胞中通过测量不同受体发射光谱串扰情况下两个连接质粒18AA和SCAT3的FRET效率验证了B-PbFRET和C-PbFRET方法的正确性和适用性。