【摘 要】
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KLF4和SOX2是重要的细胞转录因子,但其在中华绒螯蟹中从未报道,且在中华绒螯蟹精子发生过程中的功能也尚未被探明。我们首次克隆得到中华绒螯蟹es-klf4和es-sox2的CDS序列。初步研究显示,在中华绒螯蟹精巢、输精管和储精囊中Es-KLF4和Es-SOX2的m RNA和蛋白水平均呈现高表达。荧光原位杂交结果显示,es-sox2和es-klf4 m RNA信号在各时期生殖细胞的细胞核和细胞质
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KLF4和SOX2是重要的细胞转录因子,但其在中华绒螯蟹中从未报道,且在中华绒螯蟹精子发生过程中的功能也尚未被探明。我们首次克隆得到中华绒螯蟹es-klf4和es-sox2的CDS序列。初步研究显示,在中华绒螯蟹精巢、输精管和储精囊中Es-KLF4和Es-SOX2的m RNA和蛋白水平均呈现高表达。荧光原位杂交结果显示,es-sox2和es-klf4 m RNA信号在各时期生殖细胞的细胞核和细胞质中均表达强烈。体腔注射ds RNA靶向敲低Es-KLF4和Es-SOX2后,大量生殖细胞的DNA受到损伤,细胞凋亡水平和增殖能力显著升高,并伴随大量处在发育II、III的精细胞及成熟精子的细胞核畸形。为探明Es-KLF4和Es-SOX2是否会受到微环境的影响从而改变其功能,本课题在体外HEK293T细胞系中过表达Es-KLF4和Es-SOX2。在过表达Es-KLF4后,处于增殖状态的细胞比例显著降低,细胞被阻滞在G1/S期,细胞周期相关的蛋白表达量显著下降。与过表达Es-KLF4的结果相反,过表达Es-SOX2后,处于增殖状态的HEK293T细胞比例显著增加,S期细胞比例显著增加,细胞周期相关的蛋白表达量显著升高。在ds SOX2组的精巢中,Es-KLF4的转录水平和蛋白表达量显著降低,而在ds KLF4组的精巢中,Es-SOX2的转录水平和蛋白表达量则没有显著变化。启动子和DNA结合位点预测结果显示,在es-klf4启动子区域存在一条同时包含EsSOX2 DNA结合位点和es-klf4启动子的序列。进一步的染色质免疫共沉淀结果显示,在中华绒螯蟹精巢中该条序列与Es-SOX2蛋白具有天然结合的情况,并且双荧光素酶报告基因实验显示Es-SOX2对该条序列具有显著的转录调控作用。综上所述,在中华绒螯蟹精巢中,Es-SOX2能够通过直接调控Es-KLF4基因的转录,参与调节中华绒螯蟹的精子发生过程中的细胞周期、细胞凋亡和精核重塑等生理过程。值得一提的是,Es-SOX2和Es-KLF4的功能可能与其所处的微环境相关,在不同的细胞环境中,它们的功能可能会发生逆转。
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