【摘 要】
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黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）Dscam1基因包含4个可变外显子簇,即外显子4、外显子6、外显子9、外显子17簇,经互斥可变剪接可以产生38016种Dscam1蛋白亚型。Dscam1蛋白通常表现同源结合的特性,即相同的Dscam1蛋白亚型彼此结合而不同的Dscam1蛋白亚型绝大多数情况下不会相互结合。Dscam1蛋白亚型多样性为神经元的自我身份识别提供分子基础,相同Ds
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黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）Dscam1基因包含4个可变外显子簇,即外显子4、外显子6、外显子9、外显子17簇,经互斥可变剪接可以产生38016种Dscam1蛋白亚型。Dscam1蛋白通常表现同源结合的特性,即相同的Dscam1蛋白亚型彼此结合而不同的Dscam1蛋白亚型绝大多数情况下不会相互结合。Dscam1蛋白亚型多样性为神经元的自我身份识别提供分子基础,相同Dscam1蛋白亚型结合将产生排斥信号,使得神经元出现自我规避。关于Dscam1蛋白亚型多样性的研究较多,但是对Dscam1基因特定的外显子的生物学功能的了解十分有限。黑腹果蝇Dscam1基因外显子6簇最为复杂,包含48个可变外显子,目前对Dscam1基因外显子6簇的生物学功能还不完全清楚。本文应用CRISPR-Cas9基因编辑技术对Dscam1基因外显子6进行研究,并对突变体的表型进行比较分析。研究结果如下:1.基于CRISPR-Cas9技术构建了5种仅包含单个外显子6的突变体,按照保留的可变外显子在外显子6簇中的位置,将突变体依次命名为R6.8、R6.13、R6.16、R6.35、R6.46（R即retaining,保留）,以上突变体的Dscam1蛋白胞外域亚型多样性均降至396种。另一方面将纯合突变体R6.35和R6.46进行杂交获得异源突变体并且将其命名为R6.35x R6.46,简写为R6.35x46（下同）。PCR以及凝胶电泳结果显示突变体的目的片段大小与预期相符,RT-PCR和Western杂交结果也显示黑腹果蝇突变体Dscam1基因转录水平和翻译水平与野生型相比无明显差异。2.黑腹果蝇Dscam1 R6.X突变体在孵化、蛹化以及羽化过程出现不同程度的缺陷,其中R6.16发育缺陷最明显,而R6.13和R6.35x46发育缺陷程度相对较轻,暗示外显子6具有生物学功能特异性。突变体在生殖方面、运动方面也出现不同程度的缺陷,并且与性别不存在明显的联系。由此表明Dscam1基因外显子6多样性与特异性在黑腹果蝇正常生长发育中是必需的。3.免疫荧光结果显示,黑腹果蝇R6.X突变体的蘑菇体神经元出现不同程度的结构缺陷,同样树突分支神经元的形态分布与野生型相比也存在不同程度的缺陷,表明Dscam1基因外显子6的生物学功能特异性在黑腹果蝇神经元形态建成中发挥重要作用,并且如R6.35x46所示,增加外显子6多样性能够缓解突变体的神经元形态结构的异常。4.真菌感染黑腹果蝇突变体的存活结果显示,突变体R6.16存活时间降幅最明显,而R6.13和R6.35x46的降低程度相对较轻,表明黑腹果蝇Dscam1基因外显子6在免疫响应方面具有生物学功能特异性,黑腹果蝇Dscam1基因外显子6多样性也参与对病原体感染的响应过程。但在热胁迫过程中,突变体总体的存活情况与野生型差异不显著,外显子6功能特异性不明显。综上所述,本项研究表明黑腹果蝇Dscam1基因外显子6多样性在孵化、蛹化、羽化、生殖、运动、神经发育以及免疫响应等方面发挥重要的调控作用,并且外显子6表现一定的生物学功能特异性。本文在黑腹果蝇中进行保留Dscam1基因单个外显子6突变体的构建及其表型分析,初步揭示了外显子6特异性的生物学功能,也为阐明果蝇Dscam1蛋白多样性与特异性的功能研究提供一定的基础。
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